国家蛋白质科学研究设施的创新设计与研制

蛋白质结晶是指溶液中的蛋白质分子经过一定规则排列堆积，形成有序聚集体的过程。其结构特征是有序的结构框架与溶剂分子共同形成空间网状结构。影响蛋白质结晶的因素非常复杂，大致分为物理因素、化学因素和生物化学因素等。目前蛋白质结晶方法学仍是一门经验科学，尚没有一套完整的理论和方法，能够指导结构生物学家成功地获得高衍射质量的晶体[8]。高通量的结晶条件尝试，仍是获得晶体最有效的手段。自动化结晶和观察模块主要采用气相扩散法进行蛋白质结晶，具体的流程如图2-32所示。该方法的原理是水分子从低浓度结晶液自发转移到高浓度结晶液池中，导致溶液中蛋白质浓度缓慢升高而生成晶体。自动化结晶和观察模块主要由1套自动化结晶溶液配制机器人、2套自动化蛋白质结晶机器人、2套自动化晶体观察机器人、1台原位蛋白质晶体衍射仪、3间恒温恒湿的晶体房组成。该模块对于经过规模化克隆构建、蛋白质表达和纯化而浓缩收集的蛋白质溶液，通过一系列仪器设备的组合运用，进行大规模的蛋白质晶体条件筛选。

图2-32　自动化结晶和观察模块设计流程图

自动化结晶溶液配制机器人，是一个用于蛋白质结晶筛选生产的全自动液体处理系统，最多可配有30个精确的注射器泵，每一个都带有9个位点的气门头。该装置可1次容纳多达60种不同的储存溶液，可准确根据程序的设定，配制多种不同的结晶溶液，自动配制初期结晶溶液并优化结晶组合条件。

自动化蛋白质结晶机器人，是一个专门用于自动化晶体生长的高通量蛋白质结晶工作站。该机器在配置上增加了脂立方（lipidic cubic phase，LCP）功能，可以克服任何黏性溶液的不同流动性，而非接触式的加样头可以快速分配蛋白质溶液，也可以在添加了试剂的蛋白质结晶溶液中再次加入各种促进剂，使得结晶过程变得更加多元化，并配有大体积蛋白质结晶专用配液分液移液头，方便结晶溶液的配液和分液工作。

在晶体培养方面，科技人员将晶体条件筛选和晶体培养，从传统低通量手工的工作模式，转型到现代化高通量、自动化和严格控制的程序化模式。自动化晶体观察机器人实现了微米级精确蛋白质晶体培养、精确的恒定温度和振动隔离；提供多达1 000个晶体培养板的存储和培养空间；可进行精准的实验样本自动定位、智能影像捕捉拍摄，以及定时全自动化、高质量图像采集和晶体成长过程观察；晶体培养板用一维条形码进行记录和跟踪，所记录的蛋白质晶体照片存储在数据库内，多用户可同时通过网络使用数据库来观察晶体照片（图2-33）。自动化晶体观察机器人不仅可独立运转，而且可同时与2个或更多晶体培养箱连接。科技人员同时设计了专门的房间，用于自动化结晶筛选与观察，以及放置晶体培养板。该房间经过特殊设计，可以保持恒定的温度与湿度，分别在4、16和20℃满足结晶筛选与观察以及放置结晶板的特殊需求。

图2-33　通过自动化晶体观察机器人所见的晶体图像(www.xing528.com)

Visible：可见；UV：紫外；UV-TPEF：双光子激发紫外荧光（two photon excited UV fluorescence）；SHG：二次谐波发生（second harmonic generation）。

原位蛋白质晶体衍射仪，是一种对多孔结晶板中的蛋白质晶体进行原位表征和X射线衍射分析的仪器。该仪器将光学成像和X射线衍射集成在一个紧凑的系统中。光学成像可以直观地定位和选择用于衍射的目标晶体，或记录晶体的生长过程，并通过内置的微焦斑光源、光学器件和CCD检测器，对选定的晶体进行原位衍射实验。科技人员采用原位蛋白质晶体衍射仪，对多孔结晶板中正在生长的蛋白质晶体进行X射线衍射实验，达到平均每天筛选100颗蛋白质晶体的衍射质量，并分析是否为单晶、晶体的衍射能力以及晶胞参数等（图2-34），记录各项参数，选取具有高衍射能力的晶体，用于同步辐射光源的衍射数据收集和结构测定。

图2-34　原位蛋白质晶体衍射仪YLID蛋白质晶体衍射效果（详见下载图2-34，下载网址见31页脚注）

自动化结晶和观察模块经过蛋白质结晶筛选、晶体培养观察和原位衍射测试，仪器设备均正常运行和满足实验要求，达到设计的性能指标。

规模化蛋白质制备系统通过对当前自动化尖端技术方法的引进与合作研发，成功建立了包括规模化基因克隆、蛋白质表达与纯化、蛋白质性质表征与结晶观察的技术平台，可以实现从质粒构建、转化或转染、细胞培养、诱导表达，到菌体破碎、产物抽提、蛋白质纯化及结晶筛选与优化等对实验样品的全过程自动化与精密控制。该系统的蛋白质制备能力不仅为后续的蛋白质结构分析系统，同时也为蛋白质的动态分析、修饰与相互作用等研究提供了样品，是整个蛋白质结构与功能分析系统之坚实基础。