国家蛋白质纯化设施的设计与研制

由于蛋白质的多样性和个性化特征，不同蛋白质的纯化方法通常也不相同，通常需要根据蛋白质的物理和化学性质，来合理组合使用亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析和磁珠法等各种纯化方法，这样才能获得足够纯度和最大得率的目标蛋白质。

对于前期通过高通量自动化原核与真核细胞表达系统所得到的大批量样品，如何对其表达量、可溶性等性状进行规模化的初步鉴定，成为一个重要的问题。为了同时满足微克级与毫克级的快速蛋白质纯化需求，在本模块中引入2种纯化模式：小量蛋白质规模纯化系统和中量蛋白质规模纯化系统。小量蛋白质规模纯化系统的最大通量为，可以对96个微克级样品同时进行自动化纯化，并可以选择使用3种不同的方法（真空抽滤法、Phy Tips法^[16]和磁珠法）进行纯化，在短时间内对这些样品的某些功能性状进行初步确定，为后续的科研工作提供更加翔实和可信的数据资料。本平台经过大量的考察调研，与自动化生产厂家合作开发了一套高通量自动化蛋白质纯化系统。该系统最大通量为，可以对96个样品进行自动化的微克级亲和层析纯化（图2-27、图2-28）。

图2-27　高通量自动化蛋白质纯化系统设计平面图

图2-28　高通量自动化蛋白质纯化系统立体效果图

当需要制备结构研究的毫克级蛋白质样品时，可选择中量蛋白质规模纯化系统，可同时对8个样品进行自动化纯化，同时配套蛋白质纯化仪，能够快速进行蛋白质鉴定的工艺流程，让实验者在相同的时间内完成更多的事情。该系统真正实现了自动化地在线配置缓冲液，加快工艺开发，提高实验通量。整合的相关软件可以实现从最少的实验中获取最多信息；能在紧凑的时间期限内确保操作安全性；成功实现纯化样品的平稳放大。科技人员专门设计了低温房间，用于放置蛋白质纯化仪及相关辅助设备，从而不再需要具有相同功能的层析冷柜。

中量蛋白质规模纯化系统利用各设备的并联和串联运行，确保每天能够完成约25个毫克级样品的纯化，用于结构研究；约20个样品的纯化，用于功能研究。大规模蛋白质纯化模块的设计流程，如图2-29所示。

图2-29　大规模蛋白质纯化模块设计流程图

2.5.1 安装和调试

设施科技人员与生产厂家工程师紧密合作，通过严格的FAT及SAT验收流程，并经仔细严谨的调试，顺利完成了高通量自动化蛋白质纯化系统的安装调试（图2-30）。

图2-30　高通量自动化蛋白质纯化系统安装调试

2.5.2　蛋白质纯化实验流程(www.xing528.com)

采用一种带填料的吸头，进行高通量、小规模蛋白质纯化，这是蛋白质纯化的一种方法。可以对上述3个表达系统产生的小量菌体及细胞进行纯化，以确定目标蛋白质的可溶性。

①将PBS^[17]缓冲液储液槽、96孔上清液板、96孔清洗液板1、96孔清洗液板2、96孔洗脱液板，从4℃低温保存箱中取出，放在移液工作站的低温模块上。

②平衡：用带填料的吸头，在PBS缓冲液的储液槽中，吸排液200μl。以流速8.3μl／s反复吸排。每轮吸排步骤后，暂停10 s。

③捕获：用带填料的吸头，在96孔上清液板反复吸排50μl。以流速8.3μl／s反复吸排。每轮吸排步骤后，暂停10 s。

④纯化：用带填料的吸头，在96孔清洗液板1反复吸排200μl。以流速8.3μl／s反复吸排，每轮吸排步骤后，暂停10 s。采用同样的操作，在96孔清洗液板2中进行纯化。

⑤洗脱：用带填料的吸头，在96孔洗脱液板反复吸排40μl。以流速4μl／s反复吸排，每轮吸排步骤后，暂停10 s。

⑥将96孔蛋白质酶板从4℃的低温保存箱中取出，并放在移液工作站的低温模块上。

⑦从储板站中取出96孔消化板和96孔电泳板。

⑧从96孔洗脱液板中吸取10μl，分别至96孔消化板和96孔电泳板。

⑨从96孔蛋白酶板中吸取1μl至96孔消化板，并将96消化板置于室温20 min。

⑩使用自动分液仪加入2.5μl 5×SDS上样染料，至96孔消化板和96孔电泳板。

离线（手动）操作：利用高通量蛋白质电泳仪鉴定目标蛋白质。

2.5.3　测试方法和结果

根据上述自动化实验流程，科技人员使用专业的自动化控制软件系统进行图形化实验编程（参见“下载图2-10 高通量自动化蛋白质纯化系统实验流程”，下载网址见31页脚注），并使用生物样本进行测试。对于在多种体系蛋白质表达模块中产生的细胞，通过高通量自动化蛋白质纯化系统抽提，成功实现了目标蛋白质的快速获得与鉴定。