国家蛋白质科学研究（上海）设施的设计与研制成果

2.2.1　建设目标

高通量自动化生物技术，就是使用自动化的仪器设备来实现生物实验操作，取代传统手工实验操作来探索生物学问题的技术[1]。高通量自动化使得科技人员在短时间内自动化地完成大规模重复性实验操作成为可能，而且可靠性高，这对于目前的生命科学研究具有重大意义。大量的生命科学研究涉及细胞中各种蛋白质的功能、结构、相互作用以及翻译后修饰的相关研究等，而进行这些研究需要获得可供实验的高纯度蛋白质，为提供这一物质基础需要进行大量的蛋白质基因克隆构建以及重组蛋白质的表达和纯化等一系列实验。传统的手工实验方法，不仅操作过程繁杂而重复，会耗费巨大人力物力及宝贵的科研时间，还可能引入人为错误，造成实验的不可重复性。

国外多个大学及研究中心，都设立了配备高度自动化仪器的生物设施中心，以满足生物实验中日益增长的高通量自动化操作需求。高通量自动化这一概念也已从传统的高通量药物筛选，扩展到生物学的各个方向，涵盖多种生物学实验，如高通量的自动化PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）体系的构建、自动化ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）系统、自动化结晶系统等，大大提高了实验效率，降低了成本，消除了人为误差，推动了科学技术的发展。然而，国内科研界的自动化，尚处于起步阶段，绝大多数传统生物实验仍由科研工作者手动完成。自动化仪器在我国医药领域已有一定的应用，虽然绝大部分只是基本的小型液体处理系统，但取得了良好的使用效果，自动化仪器已是生物制药公司必不可少的研发工具。

我们将自动化引入规模化蛋白质制备系统中，大大节省了人力物力还有科研时间，并将引入人为错误造成实验不可重复的概率降到最低。该系统中的单个技术设备，大部分已经实现了商品化，所以关键的建设内容是：将不同的设备和部件通过系统集成的方式进行整合，从而形成完整的研究装置系统。

规模化蛋白质制备系统是全球首例汇集了整套从克隆构建、蛋白质表达、蛋白质纯化，到结晶筛选观察等高通量、自动化设备的大型系统。该系统采用自动化高通量技术与多种蛋白质表达系统研究策略相结合的设计框架，在不同表达系统的自动化模块之间设置反馈途径，对特定的目标蛋白质可根据不同表达系统的反馈信息及时调整克隆、表达和纯化的策略，以便尽快获得大量高纯度和高质量的蛋白质样品，进而为下一步蛋白质生化结构测定和功能研究提供物质基础。本套高通量自动化生物技术设备，是蛋白质科学研究领域中全球首例的综合性高通量自动化系统，填补了国内生命科学领域自动化技术应用方面的空白，在技术开发、理论摸索、基础研究以及实际应用等方面，对我国的蛋白质科学研究工作都会产生不可估量的巨大推动作用。

本平台建立和发展了规模化的克隆构建、基因表达与蛋白质纯化的技术平台，从而实现从载体构建、转染、细胞培养、诱导表达到菌体破碎、产物抽提、蛋白质纯化、样品测试等流程全过程的自动化与精密控制。在实现规模化蛋白质制备的同时，该系统所产生的蛋白质样品，不仅用于后续的结构分析研究，也为蛋白质的动态分析、修饰与相互作用研究等系统提供了样品，是结构和功能分析系统的基础。

2.2.2　技术方案

在用户提交靶基因后，科技人员根据研究目标的性质、要求和用途，选择合适的样品制备路线。首先采用规模化克隆和可溶性筛选模块，进行表达载体的构建和蛋白质的小量表达，判断蛋白质的表达量和可溶性。该过程是由机器人控制、由软件系统实现结构基因组学研究的高通量、无人干预的自动化仪器运行。从PCR到可溶性筛选（2个工作周：10 d），该模块能够完成克隆构建，并且试表达分析384个重组蛋白质的可溶性，每年可以完成近1万个重组蛋白质的可溶性表达分析。该模块主要针对原核细胞表达系统，一旦得到表达量高且具可溶性的克隆表达菌株，则进入下一模块，进行大规模的样品制备。若通过原核表达系统无法成功，则考虑采用真核（昆虫、哺乳动物）细胞表达系统。

在完成蛋白质表达筛选以后，放大生产则由蛋白质中量表达模块完成。该模块由一系列摇床、低温培养箱和发酵罐组成，设计容量确保每天能够完成约15个样品的表达用于结构研究，约10个样品的表达用于功能研究，每年可以实现近6 000个蛋白质表达的制备水平。大量蛋白质纯化模块，由一系列蛋白质纯化仪通过串联或并联的方式组成，设计容量同样确保每天能够完成约15个样品的纯化用于结构研究，约10个样品的纯化用于功能研究，每年进行近6 000个蛋白质纯化的制备能力。对纯化后的样品，通过蛋白质性质表征模块研究其理化性质，并评估其质量。如评估合格，则将其应用于本系统和其他系统的结构与功能研究。

规模化蛋白质制备系统的另一重要组成部分，是建设从蛋白质到高衍射质量蛋白质晶体的快速制备能力，这是蛋白质晶体结构研究中的限速步骤。该解决方案由自动化蛋白质结晶和观察模块组成，通过应用高通量自动化仪器解决其中的难点。该模块由一系列自动化蛋白质结晶机器人、晶体观察机器人和晶体衍射仪组成，设计容量确保每天能够完成约20个蛋白质样品（750个条件／蛋白质）的结晶条件筛选，每天约100颗蛋白质晶体的衍射质量筛选，年研究能力达到5 000个样品的结晶条件筛选和25 000颗晶体的衍射筛选的容量。(www.xing528.com)

综上，整个平台采用高通量策略和多种表达系统并行的运行方式，对特定目标蛋白质实现快速克隆、表达和纯化条件的筛选，并通过大量蛋白质纯化获得大量高纯度和高质量的蛋白质样品，快速完成自动化晶体筛选，获得高衍射质量的蛋白质晶体，满足蛋白质结构测定和功能研究之需要（图2-2）。

2.2.3　验收指标

①蛋白质表达载体构建的能力：设计容量达到平均每天构建300个蛋白质表达载体，并进行蛋白质可溶性表达水平分析。

②蛋白质表达和纯化的能力：设计容量达到平均每天表达和纯化15个蛋白质样品（毫克级）用于蛋白质结构测定和抗体生产；每天表达和纯化100个蛋白质样品（微克级）用于蛋白质功能分析；每年表达和纯化5～10个重要的蛋白质复合物和膜蛋白用于结构与功能研究。

图2-2　规模化蛋白质制备系统技术方案图

③蛋白质结晶条件筛选的能力：设计容量达到平均每天设置20个蛋白质样品的结晶条件筛选，每个样品的筛选条件为平均750个。

④蛋白晶体衍射质量筛选的能力：设计容量达到平均每天筛选100颗蛋白质晶体的衍射质量，选取具有高衍射能力的晶体用于同步辐射光源的衍射数据收集和结构测定。