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凤眼莲入侵生物学:谷氨酰胺合成酶活性测定结果

时间:2023-10-18 理论教育 版权反馈
【摘要】:取0.5g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mL GS提取液中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为GS酶粗提液。从标准曲线上查得产物γ-谷氨酰胺异肟酸含量,计算出GS活性。一个GS活性单位定义为每分钟37℃催化生成1μmolγ-谷氨酰胺异肟酸所需要的酶量。

凤眼莲入侵生物学:谷氨酰胺合成酶活性测定结果

6.1.4.1 缓冲液的配制

(1)GS提取液:

Tris-Hcl(pH7.6),100mmol/L;

β-Me,10mmol/L;

氯化镁,1mmol/L;

EDTA,1mmol/L;

PMSF,0.2mmol/L;

亮抑酶肽,50μmol/L;

甘油(V/V),10%。

(2)反应液:

咪唑缓冲液(pH7.5),100mmol/L;(www.xing528.com)

ATP,11.4mmol/L;

羟氨,45mmol/L;

硫酸镁,45mmol/L。

(3)反应终止液:

三氯化铁盐酸溶液,10%;

三氯乙酸,24%;

盐酸,50%。

6.1.4.2 GS活性测定

GS酶活性的测定按照修改后的Rhodes等(1975)的方法进行。取0.5g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mL GS提取液中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为GS酶粗提液。取1mL酶提取液加入等量反应液,在37℃下水浴15min,其间轻轻摇匀数次,加入2mL反应终止液终止反应,4℃下以4000rpm离心5min。上清液用UNICO生产的UV-2100型紫外可见分光光度计进行比色测定,比色时用540nm波长,记下光密度。从标准曲线上查得产物γ-谷氨酰胺异肟酸含量,计算出GS活性。一个GS活性单位定义为每分钟37℃催化生成1μmolγ-谷氨酰胺异肟酸所需要的酶量。

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