【摘要】:取0.5g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mL GS提取液中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为GS酶粗提液。从标准曲线上查得产物γ-谷氨酰胺异肟酸含量,计算出GS活性。一个GS活性单位定义为每分钟37℃催化生成1μmolγ-谷氨酰胺异肟酸所需要的酶量。
6.1.4.1 缓冲液的配制
(1)GS提取液:
Tris-Hcl(pH7.6),100mmol/L;
β-Me,10mmol/L;
氯化镁,1mmol/L;
EDTA,1mmol/L;
PMSF,0.2mmol/L;
亮抑酶肽,50μmol/L;
甘油(V/V),10%。
(2)反应液:
咪唑缓冲液(pH7.5),100mmol/L;(www.xing528.com)
ATP,11.4mmol/L;
羟氨,45mmol/L;
硫酸镁,45mmol/L。
(3)反应终止液:
三氯化铁盐酸溶液,10%;
三氯乙酸,24%;
盐酸,50%。
6.1.4.2 GS活性测定
GS酶活性的测定按照修改后的Rhodes等(1975)的方法进行。取0.5g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mL GS提取液中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为GS酶粗提液。取1mL酶提取液加入等量反应液,在37℃下水浴15min,其间轻轻摇匀数次,加入2mL反应终止液终止反应,4℃下以4000rpm离心5min。上清液用UNICO生产的UV-2100型紫外可见分光光度计进行比色测定,比色时用540nm波长,记下光密度。从标准曲线上查得产物γ-谷氨酰胺异肟酸含量,计算出GS活性。一个GS活性单位定义为每分钟37℃催化生成1μmolγ-谷氨酰胺异肟酸所需要的酶量。
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