克隆植物凤眼莲活性测定方法

6.1.3.1　缓冲液的配制

In vitro NR测定:

研磨液(Buffer A):

HEPES-KOH(pH 7.5)，50mmol/L；

氯化镁，5mmol/L；

EDTA，0.5mmol/L；

DTT，5mmol/L；

PMSF，0.2mmol/L；

FAD，10μmol/L；

亮抑酶肽，50μmol/L；

甘油(V/V)，10%；

PVPP(W/V)，1%；

Triton X-100(W/V)，0.1%。

分析液(Buffer B):

磷酸钾buffer(pH7.5)，50mmol/L；(www.xing528.com)

硝酸钾，10mmol/L；

NADH，0.2mmol/L；

EDTA(测NRmax)，2mmol/L；

MgCl2(测NRact)，5mmol/L。

6.1.3.2　In vitro硝酸还原酶活性测定

In vitro NR活性的测定按照修改后的Kaiser和Huber(1997)的方法进行。取0.5 g植物材料于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末后，将其悬浮于1.5mLBuffer A中。4℃以12000rpm离心20min，上清液即为NR酶粗提液。取酶液0.25mL于试管中，加入0.75mL in vitro NR分析液(包括测NRmax和NRact两种体系)，在30℃下水浴10min后，加入0.05mL 0.5mol/L的醋酸锌溶液以终止反应，并吸取反应溶液0.5mL于一试管中，加入磺胺试剂和α-萘胺试剂以显色法来测定的含量，静置10min后，用UNICO生产的UV-2100型紫外可见分光光度计进行比色测定，比色时用540nm波长，记下光密度，从标准曲线上查得含量，然后计算酶活性，以每克鲜重材料每小时催化生成的微摩尔数表示，即μmol g-1 FWh-1。NR活性用以下公式计算:

式中，X为酶催化产生的亚硝态氮总量(μmol)；

V1为酶促反应时加入的缓冲液体积(mL)；

V2为显色反应时加入的粗酶液体积(mL)；

W为样品重量(g)；

t为反应时间(h)。

NR激活状态计算公式为:

式中，NRact为Mg2+存在下的实际NR活性值；

NRmax为EDTA存在下的最大NR活性值。