谷氨酰胺合成酶活性测定结果

5.1.4.1　缓冲液的配制

(1)GS提取液:

Tris-Hcl(pH7.6)，100mmol/L；

β-Me，10mmol/L；

氯化镁，1mmol/L；

EDTA，1mmol/L；

PMSF，0.2mmol/L；

亮抑酶肽，50μmol/L；

甘油(V/V)，10%。

(2)反应液:

咪唑缓冲液(pH7.5)，100mmol/L；(www.xing528.com)

ATP，11.4mmol/L；

羟氨，45mmol/L；

硫酸镁，45mmol/L。

(3)反应终止液:

三氯化铁盐酸溶液，10%；

三氯乙酸，24%；

盐酸，50%。

5.1.4.2　GS活性测定

GS酶活性的测定按照修改后的Rhodes等(1975)的方法进行。取0.5g植物材料于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末后，将其悬浮于1.5mL GS提取液中。4℃以12000rpm离心20min，上清液即为GS酶粗提液。取1mL酶提取液加入等量反应液，在37℃下水浴15min，其间轻轻摇匀数次，加入2mL反应终止液终止反应，4℃下以4000rpm离心5min。上清液用UNICO生产的UV-2100型紫外可见分光光度计进行比色测定，比色时用540nm波长，记下光密度。从标准曲线上查得产物γ-谷氨酰胺异肟酸含量，计算出GS活性。一个GS活性单位定义为每分钟37℃催化生成1μmolγ-谷氨酰胺异肟酸所需要的酶量。