3.1.3.1 缓冲液的配制
In vitro NR测定:
研磨液(Buffer A):
HEPES-KOH(pH 7.5),50mmol/L;
氯化镁,5mmol/L;
EDTA,0.5mmol/L;
DTT,5mmol/L;
PMSF,0.2mmol/L;
FAD,10μmol/L;
亮抑酶肽,50μmol/L;
甘油(V/V),10%;
PVPP(W/V),1%;
Triton X-100(W/V),0.1%。
分析液(Buffer B):
磷酸钾buffer(pH7.5),50mmol/L;(www.xing528.com)
硝酸钾,10mmol/L;
NADH,0.2mmol/L;
EDTA(测NRmax),2mmol/L;
MgCl2(测NRact),5mmol/L。
3.1.3.2 In vitro硝酸还原酶活性测定
In vitro NR活性的测定按照修改后的Kaiser和Huber(1997)的方法进行。取0.5 g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mLBuffer A中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为NR酶粗提液。取酶液0.25mL于试管中,加入0.75mL in vitro NR分析液(包括测NRmax和NRact两种体系),在30℃下水浴10min后,加入0.05mL 0.5mol/L的醋酸锌溶液以终止反应,并吸取反应溶液0.5mL于一试管中,加入磺胺试剂和α-萘胺试剂以显色法来测定的含量,静置10min后,用UNICO生产的UV-2100型紫外可见分光光度计进行比色测定,比色时用540nm波长,记下光密度,从标准曲线上查得含量,然后计算酶活性,以每克鲜重材料每小时催化生成的微摩尔数表示,即μmol g-1 FWh-1。NR活性用以下公式计算:
式中,X为酶催化产生的亚硝态氮总量(μmol);
V1为酶促反应时加入的缓冲液体积(mL);
V2为显色反应时加入的粗酶液体积(mL);
W为样品重量(g);
t为反应时间(h)。
NR激活状态计算公式为:
式中,NRact为Mg2+存在下的实际NR活性值;
NRmax为EDTA存在下的最大NR活性值。
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