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硝酸还原酶活性测定研究结果

时间:2023-10-18 理论教育 版权反馈
【摘要】:取0.5 g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mLBuffer A中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为NR酶粗提液。NR激活状态计算公式为:式中,NRact为Mg2+存在下的实际NR活性值;NRmax为EDTA存在下的最大NR活性值。

硝酸还原酶活性测定研究结果

3.1.3.1 缓冲液的配制

In vitro NR测定:

研磨液(Buffer A):

HEPES-KOH(pH 7.5),50mmol/L;

氯化镁,5mmol/L;

EDTA,0.5mmol/L;

DTT,5mmol/L;

PMSF,0.2mmol/L;

FAD,10μmol/L;

亮抑酶肽,50μmol/L;

甘油(V/V),10%;

PVPP(W/V),1%;

Triton X-100(W/V),0.1%。

分析液(Buffer B):

磷酸钾buffer(pH7.5),50mmol/L;(www.xing528.com)

硝酸钾,10mmol/L;

NADH,0.2mmol/L;

EDTA(测NRmax),2mmol/L;

MgCl2(测NRact),5mmol/L。

3.1.3.2 In vitro硝酸还原酶活性测定

In vitro NR活性的测定按照修改后的Kaiser和Huber(1997)的方法进行。取0.5 g植物材料于研钵中,加入液氮充分研磨成粉末后,将其悬浮于1.5mLBuffer A中。4℃以12000rpm离心20min,上清液即为NR酶粗提液。取酶液0.25mL于试管中,加入0.75mL in vitro NR分析液(包括测NRmax和NRact两种体系),在30℃下水浴10min后,加入0.05mL 0.5mol/L的醋酸锌溶液以终止反应,并吸取反应溶液0.5mL于一试管中,加入磺胺试剂和α-萘胺试剂以显色法来测定的含量,静置10min后,用UNICO生产的UV-2100型紫外可见分光光度计进行比色测定,比色时用540nm波长,记下光密度,从标准曲线上查得含量,然后计算酶活性,以每克鲜重材料每小时催化生成的微摩尔数表示,即μmol g-1 FWh-1。NR活性用以下公式计算:

式中,X为酶催化产生的亚硝态氮总量(μmol);

V1为酶促反应时加入的缓冲液体积(mL);

V2为显色反应时加入的粗酶液体积(mL);

W为样品重量(g);

t为反应时间(h)。

NR激活状态计算公式为:

式中,NRact为Mg2+存在下的实际NR活性值;

NRmax为EDTA存在下的最大NR活性值。

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