克隆植物凤眼莲的ISSR引物和PCR扩增研究

所用ISSR引物由上海Shangon合成，为17~18碱基核苷酸锚定的重复序列。本实验选用了64个引物用于引物的筛选。凤眼莲25μLPCR反应体系经过优化后，包括:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，0.001%gelatin，2mmol/LMgCl2，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.2mmol/L(Promega公司)，引物500 nmol(Shangon)和1U的Taq DNA聚合酶(Promega公司)。每个反应体系中含凤眼莲DNA 30 ng，上面用50μL矿物油覆盖避免溶液挥发。本实验采用以下ISSR-PCR程序对凤眼莲基因组DNA扩增:94℃预热5min；40个循环94℃1min；50℃1min，72℃2min；最后72℃延伸10min。鸭舌草25μL反应体系包括:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，0.001%gelatin，2.5mmol/L MgCl2，dATP、dCTP、dGTP　和　dTTP　各　0.2mmol/L(Promega公司)，引物500nmol(Shangon)和1.5U的Taq DNA聚合酶(Promega公司)，鸭舌草基因组DNA 20 ng。PCR反应程序采用:94℃预热5min；40个循环94℃1min，52/55℃1min，72℃10min；最后72℃延伸10min。ISSR程序共筛选出18和14个ISSR引物分别用于凤眼莲和鸭舌草基因组的扩增(表2-3)。

表2-3　用于扩增鸭舌草7个种群的RAPD和ISSR引物

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注:*B:C/G/T；D:A/G/T；H:A/C/T；R:A/G；V:A/C/G；Y:C/T。