RAPD引物和PCR扩增分析揭示了凤眼莲的入侵生物学

所用RAPD引物来自上海Shangon，为10碱基核苷酸随机设计序列。本实验选用了160个引物用于引物筛选。凤眼莲25μLPCR反应体系经过优化后，包括:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，0.001%gelatin，1.5mmol/L MgCl2，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.2mmol/L(Promega公司)，引物7.5 pmol(Shangon)和1U的Taq DNA聚合酶(Promega公司)。每个反应体系中含凤眼莲DNA40-60ng，上面用50μL矿物油覆盖避免溶液挥发。本实验采用以下RAPD-PCR程序对凤眼莲基因组DNA扩增:94℃预热5min；42个循环94℃1min，36℃1min，72℃1.5min；最后72℃延伸10min。鸭舌草25μL反应体系包括:10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，0.001%gelatin，2.5mmol/L MgCl2，dATP、dCTP、dGTP　和　dTTP　各　0.2mmol/L(Promega公司)，引物7.5 pmol(Shangon)和1.5单位的Taq DNA聚合酶(Promega公司)，鸭舌草基因组DNA 20ng。PCR反应程序采用:94℃预热5min；42个循环94℃1min，37℃，1min，72℃1.5min；最后72℃延伸10min。样品进行扩增，在筛选随机引物时，从武汉种群中随机选取6~8个基因组DNA样品为模板，反应程序按照上述程序用不同的引物进行扩增，并做一次重复，选取含4~10条带、位点清晰、重复性好的作为正式扩增引物，RAPD程序共筛选出25和28个随机引物分别用于凤眼莲和鸭舌草基因组的扩增(表2-2)。

表2-2　用于扩增凤眼莲6个种群的RAPD和ISSR引物

续表(www.xing528.com)

注:a R＝A or G；Y＝C or T；H＝A，C or T；V＝A，C or G；B＝C，G or T；D＝A，G or T。