硝酸还原酶：克隆植物凤眼莲入侵生物学研究

硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)是植物体内氮代谢过程中一个重要的调节酶和限速酶，存在于高等植物的根、叶的细胞质中。NR所催化的还原为的反应是植物体内硝态氮同化的限速步骤，其活性在一定程度上反映了植株的营养状况和氮素代谢水平(肖焱波等，2002；Tischner，2000)。NR基本上来说有三种存在状态:自由的NR(有活性)、磷酸化的NR(pNR；有活性)以及pNR—14-3-3复合体(无活性)。这三种NR所占的比例主要取决于外在条件。由于Mg2+是pNR与14-3-3蛋白结合形成无活性复合体的必要条件，所以在有Mg2+存在的情况下，所测得的NR活性(包括NR和pNR)较低，称为NRact；当有EDTA存在时，由于Mg2+的存在被排除，所测得的NR活性为总NR活性，称为NRmax。而NRact/NRmax的比值则被称为NR的“激活状态”(Kaiser和Huber，2001)。因此，从NR的激活状态就可反映出NR在转录后水平上的调控情况。NR对环境条件十分敏感，因此对NR进行调控的相关因子很多，光、、CO2浓度等均会影响其活性，其中硝态氮和光是两个最重要的因素。

1.6.2.1　对硝酸还原酶活性的影响

对植物而言，诱导出NR活性的现象在不同物种、不同生命形式中广泛存在。在许多物种中，硝酸还原酶蛋白的再合成是硝酸还原酶活性升高的关键(Scheible等，1997)。对NR的影响只体现在转录水平上，氮的可利用性的不同通常不会改变NR的激活状态。缺氮植物中的NR蛋白和总RNA量都很低，却仍拥有和充分供氮植物一样的NR的激活状态(Kaiser和Huber，2001)。

植物根、叶中的NR的存在对的依赖性比较大，可以诱导NR的原因可能是诱导NRmRNA合成或酶原激活。NR面对所做出的第一步合成反应是相当迅速的，在暴露于中的几分钟内，NRmRNA就能升高5~100倍(Long等，1992)。此反应甚至能在蛋白合成受阻时发生，这说明诱导NR活性的主要信号是而非代谢产物，NR是一种典型的底物诱导酶。

1.6.2.2　光对硝酸还原酶活性的影响(www.xing528.com)

光是植物体内同化的必要条件，光合作用能提供同化过程中消耗的能量，以及铵态氮转换为氨基酸时所需的碳骨架等。光对NR的调控体现在转录水平和翻译后水平两个方面。在转录水平上，光对NRmRNA进行正调控，在光的诱导下，NRmRNA的积聚量会出现显著提高。而且，光诱导NR活性的提高有1~2h的滞后期，说明是重新合成了NR蛋白(Duke和Duke，1978)。光对NRmRNA水平的提高可能并非是直接的，其作用可能与光合产物有关。已有的实验证据证明，升高CO2浓度则可诱导出高NR活性，且CO2的这种作用还与供氮形式有关(Larios等，2001；Matt等，2001)。糖对NR活性也有同样的作用，在暗条件下，只要向叶片供给糖，NRmRNA的表达就会大大提升，NR活性也随之升高(Klein等，2000)。光除了在NRmRNA水平上调节NR活性外，还在翻译后水平上调节NR活性。叶中的NR在光下可表现出高活性，而在暗条件下却活性很低。在模式生物中，NR光下的激活状态为70%~90%，而暗条件下仅为10%~30%(Scheible等，1997)。光的调节与植物体内NR的NRact和NRmax这两种活性状态有关，这两种活性状态之间可以相互转变，使NR活性能够发生快速变化。这种改变是通过对NR蛋白的修饰实现的。其中，最有可能的机制是NR蛋白磷酸化/去磷酸化。高等植物中NR活性调控则是通过翻译后酶蛋白的磷酸化/去磷酸化实现的。NR活性水平与磷酸化水平关系密切，NR在光下去磷酸化，NR活性升高，在暗条件下磷酸化，NR活性降低。其主要机理可能是，NR蛋白在依赖Mg2+的蛋白磷酸激酶的催化下磷酸化后，由特定14-3-3蛋白家族的抑制蛋白与磷酸化的NR丝氨酸残基结合，通过结合该蛋白而引起NR失活。而14-3-3蛋白家族的抑制蛋白与磷酸化NR的结合需要二价金属离子的存在(Athwal和Huber，2002；Lillo等，2004)。Ca2+、Mg2+等二价金属离子可以抑制NR去磷酸化，而5’-AMP、无机磷酸、磷酸酯、糖和某些盐类可以促进NR去磷酸化(Kaiser和Huber，2001；Haba等，2001)。因而，在Mg2+存在下检测NR活性时，Mg2+使抑制蛋白-磷酸化NR复合物得以稳定存在，检测到的NR活性是去磷酸化的NR所表现出来的，即实际NR活性值(NRact)；而在检测NR活性之前，加入EDTA等络合剂可以阻止抑制蛋白-磷酸化NR复合物的形成，检测到的NR活性是全部的NR表现出来的，即最大NR活性值(NRmax)。因此，NR的表达体现出一定的昼夜节律变化(Lillo等，2001)。NR活性的最大值一般在光周期早期出现，在光周期后期和暗周期中逐渐下降。

1.6.2.3　硝酸还原酶活性在不同组织中的差异

NR活性除了受硝酸根离子和光的影响而产生变化外，在植物的不同组织间也存在较大差异。Andrews(1984)在研究中发现，木本植物或温带起源植物硝酸根还原主要在根中完成，而草本植物或热带起源植物硝酸根还原则主要在植物的地上部分完成。Cedergreen和Madsen(2003)在研究18种水生植物时发现，根冠的NR活性因物种的不同而存在差异。由于叶片能提供氮素还原所需要的能量和碳骨架，因此叶片被认为具有高的还原效率(Oks，1994)。Gojon等(1994)曾提出这样一个假说，慢速生长的木本植物，氮素还原主要在根部，而快速生长的草本植物，氮素还原主要在地上部分。并由此得出结论:快速生长的草本植物地上部分硝酸还原酶活性大于根部。这一假说是基于生长形式不同的植物来进行比较的，目前仍然存在争议。有研究表明，在植物的不同发育时期，硝酸根还原在根和叶中分布比例有很大差异，明显受到了碳水化合物和氮素化合物的影响，并且与植物的生长有密切关系(Druart等，2000)。