李斯被关进监狱后，秦二世令赵高审讯李斯，赵高刑讯逼供，让李斯承认谋反之罪，并将其宗族通通收捕殆尽。李斯经不住酷刑的折磨，承认了赵高的指控。李斯之所以没有自杀，是因为自负能言善辩，有功劳，确实没有谋反的动机。他在狱中向二世上书，在书中竭尽其辩才，希望二世省悟而赦免自己。
这时的李斯虽已招供，但依然心存侥幸，他认为自己并没有反叛之心，而且有功于秦，当年被秦始皇治罪时，曾依靠一篇《谏逐客书》而力挽狂澜，如果将自己的冤情告知皇上，说不定能得到赦免。
可惜李斯“聪明一世，糊涂一时”，胡亥怎么能与秦始皇相提并论呢？秦始皇虽然暴虐，但毕竟雄才大略，胡亥却被赵高牵着鼻子走。而且赵高耳目众多，他精心炮制的文章还没送到胡亥眼前，就落入了赵高手中，赵高冷笑一声：“阶下之囚，安得上书！”
赵高见李斯不死心，怕他会翻供，于是又派心腹装扮成胡亥派来的官员，对他进行轮番审讯，李斯信以为真，于是推翻原来的供词，说出实情，但这些“官员”对他再次严刑拷打，不许其翻供。就这样反复十余次，李斯终于不敢再改口翻供了。等到胡亥真的派御史来审讯时，李斯以为又和以前一样，是赵高安排的人，徒受皮肉之苦也不能鸣冤，因此不敢改口翻供。
胡亥见李斯承认了“谋反”，高兴地对赵高说：“若非赵君，差一点儿被宰相所卖，好险！”这时，派去调查李由的使臣也回来了，告诉赵高：“还未到三川郡，李由就被项梁杀死了。”
赵高大喜，这一下死无对证，于是他捏造出李由意图造反的信件，上报胡亥。胡亥闻言盛怒，下令将李斯具五刑，腰斩于市，并诛三族（父族、母族和妻族）。
行刑那天，围观的人多如牛毛，谁也没想到，曾红极一时的宰相会落得如此下场。
李斯走在队伍的最前列，后面是他的次子，再后面是父母妻子。
这时的李斯已须发皆白，他看着儿子，哽咽地说：“吾欲与汝复牵黄犬、臂苍鹰、出上蔡东门逐狡兔，其可得乎？”
说完父子二人抱头痛哭。后人有诗曰：(www.xing528.com)
上蔡东门狡兔肥，
李斯何事忘南归？
功成不解谋身退，
直待云阳血染衣。
很快，行刑的时辰到了，刽子手并列两旁，监刑官下令执行五刑：先在脸上刺字，然后涂墨，这叫“黥刑”，割掉鼻子叫“劓刑”，砍掉左右脚，接着施以“腰斩”，最后是“醢刑”——剁成肉酱。这种死法是当时最残忍的“施五刑”，等到五刑完毕，李斯早已魂归西天了。
其余亲属也一一诛死，只见刑场之上鬼哭狼嚎，围观者无不惊恐万状。
对于李斯的死，有人感慨，有人却认为他是罪有应得：“李斯矫诏杀扶苏和蒙恬，才让胡亥坐上皇位；他为了自己的荣华富贵，却断送了大秦江山。”
李斯的一生，颇能发人深思：他在辅佐秦始皇统一天下，建立大一统君主专制帝国的过程中，做出了一定的贡献，是秦始皇身边几个颇具政治见解的大臣之一。但他贪图爵禄，缺乏气节，在专制政治的旋涡中，不敢坚持自己的见解，甘愿与昏君同流合污。最后，不仅毁掉了自己的前半生功业，还在权力的角逐中丧生。他既是被专制政治和昏君奸佞所杀，也是为自己丧失节操所害。
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