柚皮苷与柠檬苦素促进细胞凋亡，诺米林抑制细胞增殖

本研究以高台蜜柚种子和白色海绵层为原料，分别进行柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的提取、分离纯化和检测。柠檬苦素类似物和柚皮苷的提取率分别为5.21 mg/g 和7.72 mg/g，柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的纯度分别为94.08%、93.91%和93.39%。

柠檬苦素、诺米林和柚皮苷均选择50 μmol/L 工作浓度，通过体外培养HeLa 细胞，研究其对HeLa 细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响，以不同方式探讨3 种苦味物质对HeLa 细胞的作用机制。结果显示，柚皮苷和柠檬苦素均能显著促进HeLa 细胞凋亡，柚皮苷和诺米林均能抑制HeLa 细胞增殖，3 种苦味物质均能显著抑制HeLa 细胞迁移。

近几年的研究发现，柑橘及其制品中的苦味物质对不同癌细胞的增殖均有显著抑制作用。宋淑慧等发现40 μmol/L 柚皮苷能抑制人卵巢癌SKOV3 细胞株增殖，猜测是通过下调COX-2 mRNA 及其蛋白表达而达到抗肿瘤作用［22］。胡昕等除了发现40 μmol/L 柚皮苷对人卵巢癌SKOV3 细胞株增殖的显著抑制作用外，还发现其促使p38 MARK 和ERK1/2 蛋白表达下调［23］。邹连生发现柠檬苦素类似物显著抑制人肝癌和膀胱癌细胞株的增殖，诺米林的抑制率优于柠檬苦素，且呈时间—剂量依赖效应，同时对正常体细胞无毒害作用［28］。唐莉莉等发现30 mg/mL 柠檬苦素能通过影响MCF-7 细胞周期抑制乳腺癌细胞增殖［29］。张娟娟等发现2.5 μg/mL 柠檬苦素能有效抑制人肝癌细胞株的增殖［12］。本研究通过CCK-8 实验证明了3 种苦味物质对宫颈癌细胞增殖的影响，其中柚皮苷和诺米林作用24 h 后能明显抑制HeLa 细胞增殖，而柠檬苦素抑制作用较弱，不同的柠檬苦素类似物对同一癌细胞的作用效果有较大差异。1989 年Lam 等证明了诺米林在肝脏和小肠黏膜通过诱导谷胱甘肽转移酶活性从而抑制致癌物质诱导肿瘤发生的效果明显，而柠檬苦素的作用较弱［11］。但是Miller 等发现柠檬苦素对口腔癌和皮肤癌的抑制效果显著优于诺米林，目前较为认可的解释是呋喃环在其中发挥作用，但是其具体作用机理还有待进一步研究［7］。(www.xing528.com)

目前，还有部分学者从促凋亡方向对3 种苦味物质的抑癌效果进行研究。张春艳发现柚皮苷能通过抑制增殖和促进细胞凋亡达到抗肿瘤效应，C4’-OCH3基团在抑制HepG-2 细胞增殖中发挥了重要作用［30］。Yeh 等发现柚皮苷能有效抑制致癌物质对遗传物质的破坏作用［31］。柚皮苷通过减少肿瘤坏死因子的释放，抑制细胞壁中的脂多糖释放，从而减少致癌物质对正常体细胞的破坏，维持细胞内遗传基因稳定［32］。为探究3 种苦味物质抑制癌细胞的作用机制，本研究利用实时定量PCR 实验，对Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、TNFR1、Fas、Cytochrome c 基因表达量进行了检测。柠檬苦素作用于HeLa 细胞24 h后基因Bcl-2、Bax 表达量极显著增加（P<0.01），柚皮苷作用于HeLa 细胞后基因Bcl-2 表达量极显著增加（P<0.01），证明柚皮苷有可能通过内源性途径抑制细胞凋亡。同时，死亡受体TNFR1 基因表达量有明显上升趋势，可能是其外源性凋亡途径也发挥了作用；Caspase-8 表达量无明显变化，因此TNFR1 不是通过激活Caspase-8 而调控外源性凋亡途径的，而有可能通过激活TNK/AP-1 途径发挥外源性促凋亡作用。在研究过程中发现经过3 种苦味物质处理后，HeLa 细胞的迁移速率可能变慢，为了证明猜测，笔者进行了细胞划痕实验。细胞迁移实验结果证实3 种苦味物质均能极显著抑制癌细胞转移。癌细胞扩散是癌症治疗过程中的一大难题，会导致病症加重，因此控制癌细胞扩散和减缓细胞迁移速率至关重要。本研究还发现苦味物质作用后癌细胞贴壁较弱，形态发生较大变化，活性降低，这也是细胞迁移能力显著减弱的具体体现。本研究发现，柑橘及其制品中3种苦味物质柠檬苦素、诺米林和柚皮苷对宫颈癌HeLa 细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用，能够作为一种潜在的抑制癌细胞的药物原材料进行开发和研究，实验结果可为今后的相关探索提供一定的数据支持。