竞新集：基于DNA条形码研究的结论和讨论

DNA 条形码研究包括DNA 提取、PCR 扩增、DNA 测序以及基于条形码数据库的序列比对等工作，获得高质量的基因组DNA 是进行DNA 条形码研究的前提。目前，提取植物基因组DNA 的方法有很多，如CTAB 法、SDS 法、高盐低pH 值法、尿素法、试剂盒法等［10］。CTAB 法能有效除去材料中的蛋白质、多糖和酚类等物质，但由于步骤多、试剂组成复杂、易污染等缺点，在使用上受到了一定的限制；SDS 法操作简单、温和，但对于次生代谢物、多糖等含量较高的植物，提取出的基因组DNA 质量往往不高；高盐低pH 值法操作方便省时，所需样品量少，适用于濒危植物或干燥药材DNA 的提取［11-12］；试剂盒法提取基因组DNA操作简单、快速，得到的总DNA 纯度高，近年来已被广泛采用；尿素法操作温和、简单、快速，但提取的DNA 质量不高［13］。本研究选择6 种常用的DNA 提取方法，筛选出提取银柴胡叶片、鲜根和干根的最适方法，其中试剂盒法提取3 种材料的DNA 质量和浓度都较好，因后续试验中样品处理量较大，且费用有限，考虑到提取成本，银柴胡叶片和鲜根采用试剂盒法提取DNA，而干根采用高盐低pH值法提取DNA。在用试剂盒法提取时也应注意：在漂洗吸附柱时，加入漂洗液后可静置1 min 后再进行离心，从而提高DNA 的质量；加入TE 缓冲液洗脱之前必须保证吸附材料彻底晾干，避免漂洗液中的乙醇等溶剂影响后续试验。用高盐低pH 值法提取时，应将干根提前放于-70℃冷冻过夜，可以提高材料脆性，使之易粉碎；加入提取液研磨后于65℃水浴，时间不宜过长，60 min 即可，太长会加快DNA 的降解。

银柴胡根中富含多糖、多酚、纤维和贮藏物质等，极易氧化，且蛋白质含量高，DNA 提取溶液浑浊，产率较低，在研磨前加入PVP 和β-巯基乙醇可防止多元酚类物质氧化［14］。另外，样品处理时组织研磨机的转速和时间会影响细胞破碎的效果，故对其进行优化，既能使药材研磨完全，又能降低DNA 的损失，选出的干根最佳研磨条件为1600 次/min，研磨6 min，提高了DNA 的质量和产率。(www.xing528.com)

从银柴胡鲜根中提取的DNA 浓度较干根高，但纯度相对较低，原因可能是新鲜材料活性较高，DNA 降解少，各种代谢产物和后含物含量高，在提取过程中不易去除干净；干根由于晾干过程时间长、温度高，造成DNA 大量降解，因此得率低，完整性差。而叶片提取的DNA 浓度低，可能与叶片比根取样量相对少有关。另外，以优选方法提取的银柴胡叶片、鲜根和干根总DNA 能够扩增出ITS2和psbA-trnH DNA 条形码序列。本研究根据不同方法下银柴胡叶片、鲜根和干根DNA 的提取结果，比较得出相对适合的银柴胡不同材料总DNA 提取方法，为后续的DNA 条形码分子鉴定及分子生物学研究奠定了基础。