高效DNA提取方法助力竞新集

以银柴胡的叶片、鲜根和干根为材料，分别采用2%CTAB 法、4% CTAB 法、SDS 法、试剂盒法、高盐低pH 值法和尿素法共6 种方法提取3 种材料的DNA。提取的DNA 经紫外线检测、琼脂糖凝胶电泳和PCR 扩增确定最适方法。

1.3.1 2%CTAB 法 取银柴胡叶片（长0.5～1.0 cm）、鲜根（长0.2～0.5 cm）和干根（长0.2～0.5 cm），经70%乙醇擦洗表面后放入600 μl 2% CTAB 缓冲液［2%CTAB、100 mmol/L Tris-HCl （pH 值8.0）、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%可溶性PVP］中，并加入2% β-巯基乙醇，再加2 枚直径为0.45 mm 的小钢珠，叶片和鲜根置于研磨仪上，以1400 次/min 研磨4 min，干根以1600 次/min 研磨6 min；65℃水浴30～45 min，4℃、12000 r/min 离心10 min；在上清液中加入等体积三氯甲烷、异戊醇（体积比为24∶1）充分混匀，4℃、12000 r/min 离心10 min；取上清液，重复以上步骤1～2 次，直到界面清晰为止；在上清液中加入2～3 倍体积的-20℃预冷的异丙醇，于-20℃静置30 min，4℃、12000 r/min 离心20 min；沉淀用70%乙醇洗涤2 次后，4℃、12000 r/min 离心2 min，沉淀晾干后加入100 μl TE 缓冲液（由Tris 和EDTA 配制而成）溶解，-20℃保存备用。

1.3.2 4% CTAB 法 具体步骤参考1.3.1 节，提取液为4% CTAB 缓冲液［2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl（pH 值8.0）、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、3%可溶性PVP、2% β-巯基乙醇］。

1.3.3 SDS 法 具体步骤参考1.3.1 节，提取液为SDS 缓冲液［10% SDS、50 mmol/L Tris-HCl（pH 值8.0）、100 mmol/L EDTA、1%可溶性PVP、2% β-巯基乙醇］。(www.xing528.com)

1.3.4 试剂盒法 在材料中加入GP1 缓冲液，参照1.3.1 节的方法研磨，采用植物基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）提取DNA，详细操作参照试剂盒说明书。

1.3.5 高盐低pH 值法 根据文献［9］的操作步骤进行试验，材料处理方法同1.3.1 节，提取缓冲液含0.1 mol/L NaAc、0.05 mol/L EDTA、0.5 mmol/L NaCl、3% PVP、3% SDS、1% β-巯基乙醇。

1.3.6 尿素法 在材料中加入尿素裂解液［7 mmol/L 尿素、0.3 mol/L 氯化钠、0.034 mol/L 十二烷基肌氨酸钠、50 mmol/L Tris-HCl（pH 值8.0）、20 mmol/L EDTA（pH 值8.0）］，参照1.3.1 节的方法研磨，摇匀，65℃水浴20～30 min；12000 r/min离心10 min，吸取上清液，将上清液移入另一新管中；加入等体积的三氯甲烷、异戊醇（体积比为24∶1）溶液，振荡数次混匀，12000 r/min 离心10 min；重复上述步骤；在上清液中加入2/3 体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min，12000 r/min 离心10 min；在沉淀中加入200 μl 70%乙醇洗涤2 次，4℃、12000 r/min离心2 min，沉淀晾干后加入100 μl TE 溶解，-20℃保存备用。