水处理微生物学-接种技术操作及步骤

（一）稀释平板法分离步骤

细菌纯种分离的方法有很多，本实验以稀释平板法分离。

1.取样

用无菌锥形瓶到现场取一定量的活性污泥或土壤或湖水，迅速带回实验室。

2.稀释水样

将1瓶90mL和5管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样（或其他样品10g）置于第一瓶90mL无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10-1浓度的菌液。用1mL无菌移液管吸取1mL的10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-6。稀释过程如图9.8所示。

图9.8　菌液稀释过程

3.平板的制作

取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。取1支1mL无菌移液管以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养箱内培养24～48h，然后观察结果。（注：若在无菌室内操作，倒平板按图9.9操作）取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于30℃培养24～48h后观察结果。

取无菌培养皿倒平板凝固后，倒置于30℃培养24～48h后观察结果。

（二）接种技术操作(www.xing528.com)

由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，本实验主要介绍斜面接种技术。

常用的接种用具有接种环、接种针、接种钩、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。接种环和接种针等总长约25cm，环、针、钩的长为4.5cm，可用白金、电炉丝或镍丝制成。见图9.10。上述材料以白金丝最为理想，其优点是：在火焰上灼烧红得快，离火焰后冷得快，不易氧化且无毒。但价格昂贵，一般用电炉丝和镍丝。接种环的柄为金属的，其后端套上绝热材料套。柄也可用玻璃捧制作。

图9.9　倒平板

图9.10　接种环及其他器具

斜面接种技术：是将长在斜面培养基（或平板培养基）上的微生物接到另一支斜面培养基上的方法（见图9.11）。接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上；将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人、组别、姓名等；点燃煤气灯（或酒精灯）；将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两支试管，中指位于两支试管之间，斜面向上，管口齐平。

图9.11　μ斜面接种示意图

右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌（环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧）；在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将烧过的接种环伸入菌种管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸人另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞并插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。

微生物的分离培养、接种等操作需在经紫外线灯灭菌的无菌操作室、无菌操作箱或生物超净台等环境下进行。教学实验由于人多，无菌室小，无法一次容纳所有实验者。所以，在一般实验室内进行时要特别注意无菌操作。也可多组分批进行。