通过前面的学习，我们知道，在水处理的过程中要对病原微生物进行处理，还需要利用微生物对饮用水和废水进行处理。而微生物很小，看不见，摸不着，在自然界中都是多种混杂生活的。如何取出需要的微生物来观察和研究呢？这就是纯种分离的工作。
进行纯种分离的第一步，是先寻找所需要的微生物的样品。寻找的方法有两种：
（1）从适宜于某类微生物生存的环境中寻找。例如：要筛选分解氰化物能力强的菌种，可以从有含氰废水排出的工厂附近的水沟、土壤中或含氰废水生物处理的污泥杂质里去寻找，因为在这些东西里能分解氰化物的微生物一定比别处多。
（2）从一般土壤里去寻找，因为土壤是微生物的大本营，一克土壤中含有几十万到若干亿微生物，而且种类很多，所以许多微生物的分离筛选工作常从收集土壤样品开始。
收集到样品后，如果样品中含所需微生物较多，可直接进行纯种分离；如果含所需微生物较少，则在分离之前先进行增殖培养，想办法使需要的微生物大量生长，不需要的微生物不生长。例如：在分离分解氰化物的微生物时，如果样品中这类微生物不多，就应把样品加到含有氰化物的培养基中，使它们经过一段时间的培养后大量繁殖，再进行分离。
微生物的纯种分离有两种方法：
图8.4 划线
（1）稀释平板法。将样品或经增殖培养后的样品中的微生物用灭菌过的水进行稀释后倒入培养皿，然后再倒入融化的固体培养基溶液，摇动均匀。使菌体分散在培养基内。培养基冷凝成平板时分散的菌体就被固定，经一定时间的培养后，这种被固定的单个菌体便繁殖形成一个个能被肉眼看到的菌落。这种由单个菌体发展成的菌落就是所需要的纯种。这种分离微生物的方法称为稀释平板法。
（2）平板划线法。用接种环蘸取样品稀释液，以图8.4的形式轻轻地在平板培养基上顺序划线。由于蘸到接种环上的微生物多，在开始的一些线段上，微生物可能分离不开，但逐渐就可以分离出单个的菌落。这种在平板上划线的方法称为平板划线法。
样品稀释的目的是为了使培养皿上形成的菌落不过于密集，影响菌种的分离。如果样品中含微生物不多，可以不作稀释。接种针或接种环的材料要求烧灼时很快烧红，而离开火焰后又能很快冷却，且不易氧化和没有毒性，一般用白金丝或电热丝制造（见图8.5）。
通过上述操作获得单个菌落后，就可以挑选单纯的、不同类型的菌落，用接种环接种到斜面培养基，进行再培养，并进行性能测定，以确定符合生产要求的纯种。对于废水处理来说，就是要选出对于某种特定废水具有强大氧化分解能力的菌种，以便有效地处理废水。
表8.1 是培养、分离微生物常用的培养基。
图8.5 接种针和接种环
表8.1 培养、分离微生物常用的培养基
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注 制备固体培养基时，可用琼脂做凝固剂
图8.6 所表示的是分离菌种的主要步骤。
图8.6 菌种分离的主要步骤
（1）稀释培养液以使下一步中的平板上能够长出分离良好的单独菌落（每个试管中盛9mL无菌水，左面第一试管中加1mL培养液经充分摇匀后即稀释10倍，再从此试管取1mL混合液加到邻近的1个试管，此时即稀释100倍，余类推，稀释至平板上长出的菌落很稀少为止）。
（2）一定量（如0.1mL或0.5mL）的菌液接种在平板上培养的菌落。
（3）从分离良好、菌落数在10个左右的培养麋皿上挑选不同菌落接种于斜面上。
（4）进一步用液体培养基并进行性能测定。
在操作中，所用器皿，培养基等在使用前都需进行灭菌。
培养条件的选择，是筛选中使目标集中的有效措施。根据具体要求，常用的手段主要有以下几种：
（1）控制温度。温度是最便于控制的培养条件。一般微生物最适于生长的温度在20～40℃之间，在50℃以上一般微生物就停止生长。耐高温的微生物的最适温度为50～60℃。所以要分离耐高温的微生物就要把培养皿放在50～60℃的温度中去培养，一方面有利于这些微生物的生长。另一方面又可以排除其他微生物的干扰。
（2）控制空气。培养好氧微生物，培养容器内所装液体培养基的深度就应当浅些，让空气比较容易透入下部。如采用固体培养基，可照前面所介绍的那样，把培养基装在培养皿内，凝成较大的平面，制成所谓平板。或把培养基装在试管中，凝成斜面。有条件的还可采用一种能够振荡的摇床，把装有液体培养基和菌种的培养瓶固定在摇床上，利用电动机的带动，不停地振荡，使瓶内的培养基不断搅拌，充分接触空气。摇床室应控制一定的温度。
培养厌氧微生物时，要设法把培养环境中的氧气排除。可以把培养容器放在密闭的器皿内，用真空泵把空气抽出，或利用吸收氧气的某些化学物质，把容器中的氧气除掉。
（3）控制培养基成分。对于一般依靠有机物生长的细菌，最常用的培养基是用牛肉膏、蛋白胨等调配而成。酵母和霉菌比较喜爱吃素，像土豆汁、豆芽汁和麦芽汁都是它们嗜好的“素菜”。放线菌可用淀粉进行培养。如果其他条件控制合适，在含有上述物质的培养基上发育起来的同一含菌样品的稀释液中的微生物，绝大部分是该类群的微生物。另外，还可以控制培养基的碳源来分离某些微生物。例如，纤维素和石蜡都是一般微生物所不能利用的碳源，如果筛选时所用培养基只加纤维素作为碳源时，只有能够分解纤维素的细菌方可生长。分离石油脱蜡的微生物时，如果用石蜡作碳源，那别的微生物就不能生长了。于是在这个基础上通过划线等方法进行分离。
（4）控制培养基的酸碱度（pH）。一般说来，细菌和放线菌在偏碱性的环境中生长的好；而酵母菌和霉菌在偏酸性的环境中生长的好。因此，如果要得到霉菌、酵母菌，把培养基的pH调到7或7以上一些。但这不是绝对的，各种微生物中也有例外。
（5）使用抑制剂。利用控制pH的方法来筛选菌种，效果不一定很好，因为有些霉菌也可在中性环境中生长。有的细菌也可在酸性环境中生长。更有效的办法是在培养基中加入更具有专性作用的抑制剂，抑制霉菌和酵母菌生长的抗菌素，如灰黄霉素，对于细菌和放线菌没有抑制作用；抑制细菌和放线菌生长的抗菌素，如青霉素、链霉素，对于霉菌和酵母菌没有抑制作用。在细菌中革兰氏染色阳性和阴性的细菌对某些抗菌素的反应也不同。例如青霉素在一定浓度时对于革兰氏阳性细菌具有抑制作用，而对于阴性细菌则没有作用。所以按照具体需要，在培养基中加入某些抗菌素等抑制剂，对于筛选工作是很有帮助的。
控制培养条件的方法，除上述这些外，还可能有很多方法可以采用，这需要在实践中再探索和完善。
将纯菌种直接投入生物处理构筑物内以处理废水目前还存在着一些问题。主要是：如果把大量分离出的适宜于分解某些物质的菌种投入，则这一类微生物在短时期内确能在处理构筑物内取得优势地位，从而提高该物质的去除效率，但是，废水中一般不仅仅含有1、2种杂质，生物处理构筑物内的微生物也是多种多样的，并且随时受到空气和土壤的污染，而自然界中微生物的生长则不但受到环境的影响，同时它们互相之间也发生着影响，所以处理构筑物内的优势菌种会随着条件的改变而发生变化。因此，菌种投入后经一定时间，处理效果有可能下降。更重要的问题是在于如何把分离出的菌种有效地用到生产实践中去。前面介绍的固定化微生物技术是一种较好的生物处理的新方法。
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