细菌生长曲线在水处理微生物学中的应用

如将少量细菌纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线称为生长曲线（见图3.1）。

从图3.1可见，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。

图3.1　细菌生长曲线

A—延滞期；B—对数期；C—稳定期；D—衰亡期

3.1.1.1　延滞期

研究发现，当菌体被接入新鲜液体培养基后，在起初的一个培养阶段内，菌体体积增长较快，但单位体积培养基中的菌体数量并不增加，甚至稍有减少，曲线平缓，因此这段时间称为延滞期，又叫调整期、停滞期、适应期。在此阶段，有的细菌能适应新环境，表现为细胞物质的增加，但细菌总数尚未增加；有的细菌不适应新环境而死亡，细菌数目有所减少。这一时期的细胞，正处于对新的理化环境的适应期，正在为下一阶段的快速生长与繁殖做生理与物质上的准备。在这个时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，少数菌体开始分裂，曲线出现上升趋势。

1.延滞期的特点

（1）菌体内物质质量显著增加，菌体体积增长较快，如巨大芽孢杆菌的长度可以从3.4μm增长到9.1～19.8μm。

（2）生长速率常数等于零，即每小时的分裂代数等于零。

（3）细胞内RNA与DNA尤其是RNA含量增加，原生质呈嗜碱性。

（4）胞内贮藏物质逐渐消耗，各类诱导酶的合成量增加，此时细胞内的原生质比较均匀一致。

（5）对外界不良环境，例如NaCl溶液、浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。

2.影响延滞期长短的因素

（1）菌种的类型。延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株的不同而异，从实践中可知延滞期可从几分钟到几小时、几天，甚至几个月不等，如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆菌短得多。

（2）菌龄与接种量。同一种细菌或菌株，接种用的纯培养物所处的生长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。如接种用的菌种都处于生理活跃时期，接种量适当加大，延滞期将显著缩短，甚至直接进入对数生长期。

（3）培养基的成分。接种到营养丰富的培养基中的细菌，可直接利用培养基的营养成分，延滞期短，反之则长。所以，常使发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近。

在微生物发酵工业中，如果有较长的延滞期，则会导致发酵设备的利用率降低，能耗增加，产品生产成本上升，最终造成劳动生产力低下与经济效益下降。只有缩短延滞期才有可能缩短发酵周期，提高经济效益。因此深入了解延滞期的形成机制，可为缩短或延长延滞期提供指导实践的理论基础，这对于工业、农业、医学、环境微生物学及其应用等均有极为重要的意义。

因此，在微生物应用实践中，通常可采取用处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、培养种子与下一步培养用的两种培养基的营养成分以及培养的其他理化条件尽可能保持一致等措施，可以有效地缩短延滞期。

3.1.1.2　对数生长期

细菌的纯培养物在被接种到新鲜培养基后，经过一段时间的适应，即进入生长速度相对恒定的快速生长与繁殖期，处于这一时期的细菌，其细胞按1→2→4→8…的方式呈几何级数增长，若以乘方的形式表示，即为20→21→22→23→24→…→2n；这里的指数“n”则为细胞分裂的次数或增殖的代数，也即一个细菌繁殖n代产生2n个子代菌体。这一细胞增长以指数形式进行的快速生长繁殖期称为指数期，也称对数期，见图3.2。在这一时期，有三个参数最为重要，即繁殖代数（n）、生长速率常数（R）和代时（G）。

图3.2　生长曲线的指数期

1.繁殖代数（n）

根据上述理论，培养基中细胞的最初个数和指数形式生长一段时间后的细胞个数之间存在如下关系：

N=N02n

式中　N——细胞最终数目；

N0——细胞初始数目；

n——指数生长期细胞繁殖代数。

细胞每分裂一次所需要的时间称为代时，以符号G表示，G=t/n。t是指数生长期时间，可从细胞最终数目（N）时的培养时间t2，减去细胞初始数目（N0）时的培养时间t1而求得。

t=t2-t1

因此，如果已知指数生长期的初始细胞数和指数生长期的最终细胞数，就可以计算出n。

为从N=N02n中解出n，可对上式作如下变换：

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2.代时（G）

根据n和t的概念，可用于计算在不同培养条件下不同微生物的G，是研究微生物生长动力学的重要参数。

从上式可以看出，在一定时间内菌体细胞分裂次数（n）愈多，代时（G）愈短，则分裂速度愈快。在指数生长期中，细胞代谢活性最强，生长最为旺盛。

3.生长速率常数（R）

可以用每小时分裂次数来描述细胞生长繁殖速率，即

从上式可知，R的倒数（1/R）即为代时（G）。

处于对数生长期的细胞有如下特点：

（1）生长速率常数达到最大。由于该期细菌得到丰富的营养，细菌代谢活力最旺盛，合成新细胞物质的速度最快，细菌生长迅速，细菌分裂一次所需的代时或原生质增加一倍所需的时间最短。

（2）细胞生长平衡，个体形态、化学组成和生理特性等均较一致。因为营养物质充足，有毒代谢的代谢产物积累不多，对生长繁殖影响很小，细菌几乎不死亡。

（3）酶系活跃，代谢旺盛，细菌对不良环境的抵抗力较强。

因此，在微生物发酵生产中，常用对数期的菌体作种子，它可以缩短延滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。对数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。

指数生长期的生长速率受到环境条件（培养基的组成成分、培养温度、pH值与渗透压等）的影响，也是在特定条件下微生物菌株遗传特性的反映。总的来说，原核微生物细胞的生长速率要快于真核微生物细胞，形态较小的真核微生物要快于形态较大的真核微生物。不同种类的细菌，在同一生长条件下，代时不同，如同样在培养温度为37℃的组合培养基中，结合分支杆菌和活跃消化杆菌的代时分别为792～932min和1200min；同一种细菌，在不同生长条件，代时也有差异，营养越丰富的培养基，其代时越短，反之越长。但是，在一定条件下，各种细菌的代时是相对稳定的，有的20～30min，有的几小时甚至几十小时。表3.1列出了有代表性的微生物代时（G）。

表3.1　某些微生物的生长代时

续表

3.1.1.3　稳定生长期

根据单细胞微生物指数生长规律，一个细菌如E.coli细胞的重量大约只有10～12g，但不难计算，如果其代时为20min，在指数生长48h后，所产生的细胞总量将会比地球还要重4000倍！这是不可思议的，事实上难于得到这样的结果。因为在这一时段内，一定存在某些因素抑制菌体生长与繁殖。一般而言，制约菌体生长的主要因素有：①培养基中必要营养成分的耗尽或其浓度不能满足维持指数生长的需要而成为生长限制因子；②细胞的排出物在培养基中的大量积累，以致抑制菌体生长；③由上述两方面主要因素所造成的细胞内外理化环境的改变，如营养物比例的失调、pH、氧化还原电位的变化等。虽然这些因素不一定同时出现，但只要其中一个因素存在，细胞生长速率就会降低，这些影响生长因子的综合作用，致使群体生长逐渐进入新增细胞与逐步衰老死亡细胞在数量上趋于相对平衡状态，这就是群体生长的稳定期。

稳定期有如下特点：

（1）此时细胞生长缓慢或停止，有的甚至衰亡，细胞的净数量不会发生较大波动，生长速率常数（R）基本上等于零。但细胞包括能量代谢和一系列其他生化反应的许多功能仍在继续。

（2）细菌细胞开始积累贮藏物质，如肝糖、异染颗粒和脂肪粒等，一些细菌形成荚膜，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。

（3）活菌数达到最高水平，如果为了获得大量活菌体，就应在此阶段收获。

（4）代谢产物的积累开始增多，逐渐趋向高峰。稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关，生产上常常通过补料、调节pH值、调整温度等措施来延长稳定生长期，以积累更多的代谢产物。

3.1.1.4　衰亡期

一个达到稳定生长期的微生物群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率逐渐上升，以致死亡菌数逐渐超过新生菌数，群体中活菌数下降，曲线下滑。在衰亡期的菌体细胞形状和大小出现异常，呈多形态，或畸形，有的胞内多液泡，有的革兰氏染色结果发生改变，许多胞内的代谢产物和胞内酶向外释放等。产生衰亡期的原因主要是外界环境条件对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。

通过对细菌生长曲线的分析，可见：

（1）细菌在对数生长期生长速率最快。

（2）营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起的培养条件的变化，是限制培养液中细菌继续快速增殖的主要原因。

（3）用生命力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延滞期，加速进入对数生长期。

（4）补充营养物，调节因生长而改变了的环境如pH值、氧化还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长对数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。

（5）对数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。