1.分光光度计的工作原理
分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射激发下，产生对光吸收的效应（图1－3）。物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有各自的吸收光谱，因此某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，其能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，即符合朗伯比尔吸收定律表达式：
图1－3 单色光通过溶液示意图
式中：A——吸光度；
I——透射光强度；
I0——入射光强度；
k——吸收系数；
b——溶液厚度；
C——溶液浓度；
T——透过率。
从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时，透过光随溶液的浓度的变化而变化的，分光光度计就是根据上述基本原理而设计的。
2.分光光度计的组成与构造
各种型号的分光光度计基本上都是由五部分组成：①光源；②单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；③样品室；④接受检测放大系统；⑤显示器或记录器（图1－4）。
图1－4 分光光度计的构造框图
3.分光光度计的使用
1）721型分光光度计
（1）使用仪器前，使用者应该首先了解仪器的结构和工作原理，以及每个操作旋钮的功能。在未接通电源之前，应该对于仪器的安全性进行检査，电源线接线应牢固，接地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。
（2）在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
（3）将仪器的电源开关接通，打开比色皿暗箱盖，选择需用的单色波长，灵敏度选择请参照（4），调节“0”电位器使电表指针指“0”，然后将比色皿暗箱盖合上，比色皿座处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，旋转调节“100%”电位器使电表指针到满度附近。仪器预热约20min。
（4）放大器灵敏度有5档，逐步增加，“1”档最低。其选择原则是在保证能使空白档良好调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置于“1”档，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后须按（3）重新校正“0”和“100%”。
（5）预热后，按（4）连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可以进行测定工作。
（6）如果大幅度改变测试波长，在调整“0”和“100%”后稍等片刻（钨灯在急剧改变亮度后需要一段热平衡时间），当指针稳定后重新调整“0”和“100%”即可工作。(www.xing528.com)
2）VIS－723G型可见光分光光度计（图1－5）
图1－5 VIS－723G型可见光分光光度计
（1）VIS－723G型可见光分光光度计的基本参数和技术指标：
波长范围：330～1 100nm最小波长间隔：0nm
波长准确度：±1nm飘移：≤0.004A／h（500nm处）
（2）按键说明：
①RESET：系统复位键，按下此键后，仪器将重新自检，所有测量结果丢失，相当于切断再开启系统电源，但钨灯不会受到影响。
②数字键：包括0～9、负号、小数点、CE（清除键，错按了数字键但没有按“ENT”时可用），用于数据输入。其1、2、3、4还可用于菜单项选择。
③PRN：打印键，在图谱处理、数据查询、活性计算、浓度测量、定波长及浓度的测量结果等界面下有效。
④CELL：比色皿配对误差校正开关键，在主界面下用于比色皿配对，在定波长、浓度、动力学的参数界面下作为比色皿配对误差校正开关。
⑤100%T：透过率调百键（即吸光度为零），仅在实时测量和测建曲线界面下有效。
⑥MODE：方式控制键，在主界面下用于选择光度测量方式为定波长或扫描（同时仪器自动选择对应的数据处理方式），在其余界面下用于选择显示方式为T或A。
⑦SET：设置键，通常在修改参数时用到（按下后有字符闪烁），在实时测量界面下用于修改系统时间和日期，在主界面下用于进行波长校正。
⑧ESC：返回键，用于取消操作或退回上一级界面。
⑨ENT：确认键，用于数据输入的确认，在字符闪烁时若不需要修改应按“ENT”确认。
⑩↑：上行键，用于向上翻页，在“图谱缩放”功能下用于游标手动左移，此键与“－”键共用。
↓：下行键，用于向下翻页，在“图谱缩放”功能下用于游标手动右移，在波长扫描的参数界面下用于选择扫描速度，在动力学扫描的参数界面下用于选择计时单位（分或秒）。
（3）VIS－723G型可见光分光光度计
①开机前，检查各电缆是否连接正确、可靠，电源是否符合要求，全系统是否可靠接地，全部达到要求后可通电运行。
②开启仪器电源，钨灯点燃，仪器自检，自检过程中，不得打开样品室盖。
③每次开机自检后，应先预热30min，再进行测量。
④自检“OK”并预热一段时间后，可以按“ESC”进入仪器主界面，开始测量工作。
⑤样品浓度测量须先用标准样品建立标准曲线，然后测未知浓度样品。
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