(一)实验目的
1.掌握微生物实验的基本操作技能。
2.学会用载片培养法培养真菌。
3.观察青霉、曲霉和假丝酵母的发育过程和它们的形态特征。
(二)实验原理
载片培养是培养和观察研究真菌或放线菌生长全过程的一种有效方法。通常只要把菌种接种在载玻片中央的小琼脂块培养基上,然后覆以盖玻片,再放在湿室中作室温培养,就可随时用光学显微镜观察其生长发育的全过程,且可不断摄影而不破坏样品的自然生长状态。
真菌载片培养的方法很多,这里介绍一种我们自行设计的采用营养较贫乏、载片与盖片间空间十分狭窄的载片培养,由此可以看到菌丝疏密恰当、特征构造明显、菌丝和产孢子构造分布在较狭窄平面上的良好标本。它不但易于显微镜观察和摄影,还可通过固定、染色和封固制成固定标本加以保存。
(三)实验材料和器皿
1.菌种 ①产黄青霉;②黑曲霉;③热带假丝酵母。
2.培养基 马铃薯琼脂培养基(原配方以无菌水作3∶1稀释,以调整其硬度和降低营养物的浓度)。
3.试剂 20%甘油乳酸苯酚固定液(乳酸10g,结晶苯酚10g,甘油20g,蒸馏水10mL)。
4.器皿 培养皿、载玻片、玻璃搁棒、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜等。
(四)实验方法和步骤
1.霉菌的载片培养
(1)准备湿室：在培养皿底铺一层等大的滤纸,其上放一玻璃搁架、一块载玻片和两块盖玻片,盖上皿盖,其外用纸包扎后于121℃下湿热灭菌20min,然后置60℃烘箱中烘干,备用。
(2)熔化培养基：将试管中的稀马铃薯葡萄糖琼脂培养基加热熔化,然后放在60℃左右的水浴(烧杯)中保温,待用。
(3)整理湿室：以无菌操作法用镊子将载玻片和盖玻片放在搁棒上的合适位置处。(www.xing528.com)
(4)点接孢子：用接种针挑取少量孢子至载玻片的两个合适位置上。
(5)覆培养基：用无菌细口滴管吸取少量熔化培养基,滴加到载玻片的孢子上。培养基应滴得圆整扁薄,直径约为0.5cm。
(6)加盖玻片：用无菌镊子取一片盖玻片仔细盖在琼脂培养基上,防止气泡产生,然后均匀轻压,务必使盖片与载片间留下约1/4mm高度(严防压扁)。
(7)保湿培养：每皿倒入约3mL20%的无菌甘油,以保持培养湿度,然后置28℃恒温培养。10h后即可不断观察其孢子萌发、菌丝伸展、分化和子实体等的形成过程。
(8)详细镜检：从湿室中取出载玻片标本,置低倍镜或高倍镜下认真观察霉菌标本中营养菌丝、气生菌丝和产孢子结构的形态及特征性构造,如曲霉的顶囊、足细胞、青霉孢子梗的对称性等。
2.假丝酵母的载片培养
准备湿室、熔化培养基和整理湿室的步骤同上。
(1)滴培养基：用灭菌后的细口滴管吸取少量熔化的马铃薯葡萄糖琼脂培养基滴加到载玻片的两个适当位置上,随即涂成圆而薄的形状。
(2)取菌接种：用接种环从斜面菌种上挑取极少量菌苔,轻轻接至培养基中央(不使培养基破损),盖上盖玻片后轻压,留出狭窄的空间。
(3)保湿培养：如前,倒入20%的无菌甘油至湿室,置28℃恒温箱中培养48h后观察假菌丝体等特征性构造。
(五)结果记录
1.观察并描述实验中选用的各霉菌和假丝酵母斜面菌种的形态特征。
2.把显微镜下观察到的曲霉、青霉和假丝酵母的菌丝体和特征性构造(足细胞、分生孢子头、分生孢子梗、分生孢子、假菌丝等)绘图并记录在下表中。
(六)注意事项
1.制作载片培养时,接种的菌种量宜少,培养基要铺得圆且薄些,盖上盖玻片时,不使气泡产生,也不能把培养基压碎或压平而无缝隙。
2.观察时,应先用低倍镜沿着琼脂块的边缘寻找合适的生长区,然后再换高倍镜仔细观察有关构造并绘图。
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