PDA培养基配制详解

(一)实验原理及用途

1.原理 马铃薯浸出粉有助于各种霉菌的生长;葡萄糖提供能源;琼脂是培养基的凝固剂。

2.用途 是一种普遍用于酵母菌、真菌和霉菌计数培养用的培养基,被推荐用于各类食品和饮料中酵母菌、霉菌检测和真菌的计数。

(二)实验材料及药品

马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 mL、自然pH等。

(三)实验器材

天平、称量纸、电磁炉、烧杯(最好是瓷的)1000mL、刀、纱布、玻璃棒、试管、培养皿、三角瓶、棉塞、报纸、线绳、记号笔、灭菌锅、超净工作台、接种针、酒精灯、酒精棉花、培养箱、显微镜、载玻片、盖玻片等。

(四)实验步骤

1.称量 称量去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15～20g。

提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量,质量好的15g就够了,质量差的应适当增加。另外,在夏天气温较高时,适当增加用量。

2.将马铃薯切成小块,放入锅中,加水1000mL,煮沸30min,用纱布滤去马铃薯残渣。

3.将马铃薯滤液放回锅中,加入琼脂,加热熔化。

提示：在琼脂熔化的过程中需要用玻璃棒不断搅拌,并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

4.加入葡萄糖 葡萄糖溶解后,加入适量的水以补充加热过程中损失的水分,定容至1000mL。

提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度,如1000mL、2000mL等,在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。(www.xing528.com)

5.分装 根据不同的实验目的,可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管,其量为管高的1/5,灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

6.加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花,棉塞可过滤空气,防止杂菌侵入并减缓培养基水分的蒸发,故在植物病理学研究工作中普遍使用。正确的棉塞是形状、松紧与管口或瓶口完全适合,过紧时妨碍空气流通,操作不便;过松则达不到滤菌的目的,且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大,约有1/3在外,2/3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞,引起污染。

7.包扎 加塞后,将试管用线绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。

8.灭菌 将上述培养基以0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌20min。

9.搁置斜面 将灭菌的试管培养基竖置冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多),将试管口端摆放在玻璃棒或其他合适高度的器具上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。培养基经灭菌后,必须放在37℃温箱培养24h,无菌生长方可使用。

10.接种 接种前用75%的酒精棉花擦拭台面,然后打开紫外灯照射消毒,并打开风机吹20～30min,将台面上含有杂菌的空气排除,保持台面处于无菌状态。

点燃酒精灯,将接种针在酒精灯外焰上充分灼烧,杀死工具表面附着的杂菌,工具灭菌后不得再接触台面。左手拿一支母种斜面和一支空白PDA培养基,右手拿灭菌后的接种钩,将两个棉花塞同时拔掉,夹在右手的无名指和小拇指、小拇指和掌根之间,不可将棉塞放到台面上。拔掉棉塞后,试管口要在酒精灯火焰上方3～5cm处,利用火焰封口,然后用接种钩切取少量母种,迅速通过酒精灯火焰,放到空白培养基斜面中央,轻压以防止滑动。最后塞好棉塞。或将PDA培养基倒平板,待凝固后接种,在无菌操作条件下蘸取母种上的菌丝,以划线方式接种到平板上。

11.将接种完的试管棉塞再次旋紧以防脱落,然后将它插在试管架上,或将平板倒置于28℃培养箱中培养7d,观察菌苔的生长情况。

(五)注意事项

1.培养基经灭菌后,必须放在28℃培养箱中培养24h,无菌生长者方可使用。

2.PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基,一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时,可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液,防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

3.培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基,用于菌类的振荡培养。

4.培养基也可以加入氯霉素或土霉素,加入量为0.2g/L培养基,主要是为了抑制细菌的生长,减少干扰。