无菌操作技术：保证培养物纯净的关键

在微生物的分离和培养过程中必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作技术,就是在分离、接种、移植等各个操作环节中必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器或系统内,避免污染培养物。无菌操作技术广泛应用于微生物、组织培养及基因工程等领域。

无菌操作技术,简单地说就是在无菌环境中进行的操作,为保证获得纯净的培养物,需要考虑各种因素的影响。

(一)培养基灭菌

培养基一般采用高压灭菌,将培养基放在高压锅中,排净冷空气后,在121℃灭菌20～30min,保证培养基处于无菌状态。

(二)创造无菌接种环境

无菌操作必须在无菌条件下进行。常见的无菌场所有净化工作台、接种箱和接种室。在进行操作前需将灭菌后的培养基以及接种用的酒精灯、工具等放到接种场所,然后采用物理或化学方法进行环境处理。

1.净化工作台 操作前用75%的酒精棉擦拭台面,然后打开紫外线灯照射消毒,并打开风机吹20～30min,将台面上含有杂菌的空气排除,保持台面处于无菌状态。

2.接种箱 操作前按照每立方米空间用10～14mL甲醛和5～10g高锰酸钾进行混合熏蒸,熏蒸时间不少于30min。或用市售气雾消毒剂进行熏蒸,每立方米空间用4～5g。接种箱中如有紫外线灯时,同时打开。

3.接种室 灭菌方法同接种箱。为避免药害,接种前可以喷洒甲醛用量一半的氨水来中和残留的甲醛。

(三)手和物体表面的消毒

先用肥皂水洗手,再用75%的酒精棉球擦拭手表面或者超净工作台、物体表面等。(www.xing528.com)

(四)工具灭菌

点燃酒精灯,将接种工具在酒精灯外焰上充分灼烧,杀死工具表面附着的杂菌,工具灭菌后不得再接触台面。

(五)无菌操作(以转管为例)

左手拿一只母种和一支空白PDA培养基,右手拿灭菌后的接种钩,将两个棉塞同时拔掉,夹在右手的无名指和小拇指、小拇指和掌根之间,不可将棉塞放到台面上。拔掉棉塞后,试管口要在酒精灯火焰上方3～5cm处,利用火焰封口,然后用接种钩切取少量母种,迅速通过酒精灯火焰,放到空白培养基斜面中央,轻压以防止滑动,最后塞好棉塞。

(六)培养

将接种后的菌种放到适宜的环境下培养。培养环境要注意消毒,防止培养过程中杂菌侵染菌种。

(七)检查

培养过程中要经常检查菌丝生长情况,发现有杂菌污染的菌种要及时挑出。

在进行微生物分离纯化以及其他无菌操作时,主动培养自己的无菌意识,加强训练,提高熟练程度,降低污染率。