消毒与灭菌两者的意义有所不同。消毒一般是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体,而灭菌则是指利用强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。在日常生活中两者经常通用。灭菌的方法一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。
(一)物理灭菌
物理灭菌是最常用的灭菌方法。主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭菌等。
1.热力学灭菌 可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。
(1)干热灭菌
干热灭菌主要原理是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性从而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时,当环境与细胞内的含水量越大,则蛋白质凝固就越快;含水量越小,凝固越慢。因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度更高(160～170℃),时间更长(1～2h)。进行干热灭菌温度不得超过180℃,否则包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦,甚至会引起燃烧。通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱(或称烤箱)进行灭菌,主要用于玻璃器皿如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好或装入特制的灭菌筒内,装入箱中,不要摆得太挤,以免妨碍热空气流通。逐渐加温,使温度上升至160～170℃后保持2h。灭菌结束后,切断电源,自然降温,待箱内温度降至70℃以下后才能打开箱门,以免玻璃器皿炸裂。
另外,灼烧灭菌也属于干热灭菌。在进行无菌操作时,接种工具如接种环、接种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧,试管口、菌种瓶口在火焰上作短暂灼烧灭菌等。
(2)湿热灭菌
湿热灭菌又分为高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、煮沸消毒法和超高温灭菌。
①高压蒸汽灭菌：此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度,导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低;二是湿热的穿透力比干热大;三是湿热的蒸汽有潜热存在,在100℃时,每1g水由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压,所以,当水蒸气中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。
一般培养基在0.11MPa,121℃20～30min可达到彻底灭菌的目的。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌,也可用于玻璃器皿的灭菌。
②常压蒸汽灭菌法：在不具备高压蒸汽灭菌的情况下,常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。对于不宜用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸气灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸气灭菌器进行灭菌,也可用普通蒸气笼进行灭菌。由于常压,其温度不超过100℃,仅能使大多数微生物被杀死,而芽孢细菌却不能在短时间内杀死,因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌,达到彻底灭菌的目的。(www.xing528.com)
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内,每天加热100℃,保持30min,连续3天。第一天加热后,其中的营养体被杀死,将培养物取出放室温下18～24h,使其中的芽孢体发育成营养体。第二天再加热100℃,保持30min,发育的营养体又被杀死,但可能仍留有芽孢,故第三天再重复一次,使其彻底灭活。
③煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10～15min,可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢。如延长煮沸时间,并加入1%碳酸氢钠或2%～5%石炭酸,效果更好。人用注射器和手术器械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌,或采用一次性无菌用品。
④超高温灭菌(UHTS)：是指在温度和时间标准分别为130～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺,其最大优点是既能杀死产品中的微生物,又能较好地保持食品品质与营养价值。超高温灭菌工艺的应用,使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实,从而打破了地域和季节的限制。
超高温灭菌自20世纪80年代以来已在世界各国广泛应用。我国改革开放以来,超高温灭菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产工艺中。
2.过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热灭菌和消毒灭菌方法,有效成分均会被热破坏,因此可以采用过滤除菌方法,应用最广泛的过滤器主要有以下几类。
①蔡氏过滤器：该过滤器由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属(银或铝)漏斗组成,分上下两节,过滤时,用螺旋把石棉板紧紧夹在上下两节滤器之间,然后将溶液置于滤器中抽滤,每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小滤板分为三种型号：K型最大,作一般澄清用;EK型滤孔较小,用来除去一般细菌;EK-S型滤孔最小,可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。
②微孔滤膜过滤器：这是一种新型过滤器,其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。孔径分为0.025μm、0.05μm、0.10μm、0.20μm、0.30μm、0.45μm、0.60μm、0.80μm、1.00μm、2.00μm、3.00μm、5.00μm、7.00μm、8.00μm和10.00μm。过滤时,液体和小分子物质通过,细菌则被截留在滤膜上。实验室中用于除菌的滤膜孔径一般为0.20μm。但若要将病毒除掉,则需要更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜不仅可以用于除菌,还可以用来测定液体或气体中的微生物,如水的微生物检查。过滤除菌法应用十分广泛,除实验室用于某些溶液、试剂的除菌外,在微生物工业上所用的大量无菌空气及微生物工作使用的净化工作台都是根据过滤除菌的原理设计的。
3.紫外线灭菌 紫外线波长在200～300nm,具有杀菌作用,其中以265～266nm范围杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中的核酸吸收,造成细胞损伤而杀菌。紫外线灭菌在微生物实验及生产实践中应用广泛,无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。此外,采用60Co-γ射线灭菌已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜,各种积层材料制作的容器及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强,可在厚包装完好条件下灭菌。
(二)化学药品消毒
化学药品灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂,如重金属离子等。只是阻止细菌代谢机能,使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂,如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处环境等有关。
微生物实验室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25%新洁尔灭、0.1%升汞、3%～5%的甲醛溶液、75%乙醇溶液等。
消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的环节和实用技术,而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。
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