1.仪器介绍及用途
PCR仪(图3-30)的应用范围广泛,几乎所有的生命科学领域都要涉及,如食品检测、临床检验、疾病控制、检验检疫、实验室科研、食品安全、化妆品检测、环境卫生等。
图3-30 PCR仪
2.工作原理
利用升温使DNA变性,在聚合酶的作用下使单链复制成双链,进而达到基因复制的目的。
3.使用方法
(1)开机：打开开关,视窗上显示“SELF TEST”,显示10s后,显示RUNENTER菜单,
,准备执行程序。
(2)放入样本管,关紧盖子。
(3)如果要运行已经编好的程序,则直接按“Proceed”,用箭头键选择已储存的程序,按“Proceed”,则屏幕显示：
,按“Proceed”选 择ENABLE,则开始执行程序。
(4)如果要输入新的程序,则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTERPROGRAM,按“Proceed”,屏幕显示
,按“Proceed”。①选择NEW,命名新的程序,最多8个字母,输入后按“Proceed”确认。②输入程序步骤：名字输入后,显示
,按“Proceed”则可以输入温度(0～100℃),按“Proceed”确认后,则可以输入孵育时间,用“Select”键移动光标,输入数字,完成后按“Proceed”确认,跳到下一步,输入方式同上。③选择GOTO,输入循环步骤时链接到第几步(循环数最多可达9999次)(为实际循环数-1)。④选择option,显示
再选择INCREMENT,按“Proceed”确认,输入初始的温度,确认后输入时间,按“Proceed”确认,然后输入每个循环增加或减少的温度,增加用正值,减少用负值(-0.1～6℃),按“Proceed”确认。选择EXTEND,按“Proceed”确认,输入每个循环增加或减少的时间(-60～60s),按“Proceed”确认。选择SLOPE(指温度上升或下降的速率),输入温度的改变值(-0.1～1.5℃)按“Proceed”确认,然后输入加热或制冷的速度,按“Proceed”确认。选择END,输入结束步骤。
(5)输入完成的程序后,到RUN-ENTER菜单,选择新程序,开始运行。
(6)其他：用“Pause”可以暂停一个运行的程序,再按一次继续程序。用“Stop”或“Cancel”可停止运行的程序。
4.注意事项
PCR检测微量感染因子时,容易因为污染而导致各种问题。因此,进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大限度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。(www.xing528.com)
(1)划分操作区：目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：①标本处理区;②PCR扩增区;③产物分析区。凝胶电泳分析,各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
(2)分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA。
①PCR用水应为高压的双蒸水。
②引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制。
③引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。
(3)实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应时谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意。
①戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套。
②使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染。
③避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
④操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样既可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度。
⑤最后加入反应模板,加入后盖紧反应管。
⑥操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性。
⑦尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其他两个区。
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