3.1.1 泥沙样品
泥沙中值粒径为0.008 8mm,黏粒含量为33%。
3.1.2 培养基
培养基中含有葡萄糖(20.0g/L)、硫酸镁(0.2g/L)、Na2HPO4(2.0g/L)、KH2PO4(1.0g/L)和NH4Cl(1.0g/L)。
3.1.3 细菌筛选
将泥沙样品与营养液一起培养,富集微生物。然后对细菌进行初筛和二次筛选。
(1)在无菌条件下,将少量泥沙样本放入蒸馏水,搅拌形成混合物。
(2)准备6只每管装有9ml无菌水的玻璃试管并编号,取1ml中泥样加入1号试管,经涡旋振荡后取其中的1ml加入2号试管,依次进行稀释,得到泥样浓度为10-1~10-6的梯度。
(3)将每种稀释梯度的0.1ml样品贴于培养基板上,在30°C下培养,直至菌落生长。菌落的筛选指标是黏度(用接种环钩取菌落可成丝,即有“成丝”现象)进行反复划线分离,分离得到的单菌落作为复筛菌株,斜面保藏筛选得到的菌株,如图6-1所示。
将分离的单菌落保存在斜培养基上进行二次筛选,筛选指标为EPS产量高、生长快。首先,挑取2~3环斜面菌种接种于种子培养基,30℃,160r/min培养1天。然后,按10%菌液量接种到发酵培养基(250ml三角瓶,装液量为50ml),30℃,160r/min培养3天。培养结束后收集培养基,以4 000r/min离心15min。最后,从上清液中提取EPS,从沉积物中进行多级分离筛选,获得了一株EPS产率较高的细菌菌株,并在初步试验中获得了延缓泥沙沉降速度的能力,进行16SrDNA鉴定。
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图6-1 用接种环钩取菌落可成丝的现象
3.1.4 微生物培养
将泥沙在250°C条件下烘干6小时灭菌,并在试管中预先培养筛选出的细菌作为菌种。然后,在一个容器内将含沙量为80.0kg/m3的泥沙、营养基、纯净水和接种菌(4.5%)混合形成浮泥。浮泥(称重法测量初始密度为1 050kg/m3)被等分并装入4个密闭的容器,而且在整个培养过程中都保持密闭状态。通过几条管子向密闭容器内底部输送经灭菌的空气以满足微生物生长所需,并扰动浮泥以免其沉降密实。在室温(约20°C)条件下培养了2批浮泥。第一批培养了11天,第二批为12天。另外,为了提高生物量和EPS含量,第二批浮泥的初始接种量也有所增加,并在培养过程中补充营养基。
3.1.5 EPS提取
在培养过程中定期从每个容器中采集浮泥样品,测量EPS含量、pH值、残糖及其他参数。采用超声法从淤泥中提取EPS,而EPS中的多糖含量测量采用以葡萄糖为标准的phenol-sulfuric 酸法,蛋白含量以荧光马里蓝法测量。
3.1.6 浮泥密实试验
将分别在四个容器培养后的浮泥汇集到一个容器中充分搅拌混合,然后采样测量密度和EPS含量,并作为试验的初始值。试验结果列于表6-1中。然后,浮泥被分入多个的容器(试验组),并加入不同量的盐。每组的盐度值也列于表6-1。每组浮泥进一步被分为多组,并分别倒入直径0.2m、高度1.0m的透明有机玻璃管。最后,将所有的管密封并在室温条件下(20°C)保持静水状态数十天。除了这两批浮泥外,作为对照,没有微生物和EPS的“干净”浮泥也在相同条件下进行了试验。
当浮泥被倒入透明有机玻璃管后,在重力作用下开始密实。很快,部分水从浮泥中分离出来并保留在上层,并形成一个水-泥界面。界面高度可以从贴在管子外面的毫米精度的标尺读取。
表6-1 密实试验初始条件
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