1.实验原理
（1）利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
（2）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷（pH8.0～8.3为负电荷）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色（如溴化乙锭等），可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2.实验步骤
（1）移液：用微量移液器按照PCR反应体系的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
（2）离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
（3）反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（4）配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料（如溴化乙锭、亚甲基蓝等）混匀。
（5）制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
（6）加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂，如溴酚蓝，作为电泳指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
（7）电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂（如溴酚蓝）前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
（8）观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
温馨提示
①凝胶电泳是鉴定特定DNA序列的基本方法。
②电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。(www.xing528.com)
③为避免外源DNA污染，实验中的离心管、枪头和蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌。
④扩增不成功的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
⑤如果扩增结果不止一条条带，可能原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
⑥PCR与细胞核内DNA复制的比较：
检测目的基因是否导入受体细胞（拓展）
1.载体表型选择法（借助标记基因检测）
（1）抗药性筛选法：
大肠杆菌pBR322[1]质粒含有标记基因：氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr），外源DNA插在BamHⅠ位点处。将细菌涂布在含有氨苄青霉素（Amp）的固体平板上进行第一轮筛选，未转化的则不能生长，转化成功的能长出菌落。上述转化成功的受体细胞有两种类型，即含重组质粒的细胞和含空载质粒的细胞。为了进一步区分这两类受体细胞，需要采用图示的方法进行第二轮筛选，由于外源DNA片段在BamHⅠ位点的重组导致质粒的Tetr基因失活，含重组质粒的受体细胞呈AmprTets表型（上标“r”代表抗性；“s”代表敏感）；而含空载质粒的受体细胞则为AmprTetr表型。因此，含重组质粒的受体细胞只能在Amp平板上生长，含空载质粒的受体细胞可出现在同时含Amp和Tet的平板上。
（2）（蓝白斑）显色筛选法：
很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ标记基因，其表达的β-半乳糖苷酶可将一种无色的化合物（X-gal）分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18/19[2]同时携带Ampr和lacZ两个标记基因，外源DNA插在lacZ标记基因内部的任何限制酶切割位点处。将细菌涂布在同时含有Amp和X-gal的固体培养基上，在长出来的菌落中，蓝色菌落的为含空载质粒的受体细胞，白色菌落的为含重组质粒的受体细胞。
2.PCR和核酸分子杂交技术（更加精准）
（1）PCR技术检测：根据目的基因的序列设计PCR引物，利用待检DNA为模板进行PCR，再通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物。
（2）核酸分子杂交（原理：碱基互补配对）：
核酸分子杂交利用核酸探针检测特异的核苷酸序列，核酸探针是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA。利用探针检测目的基因的简要方法是：用化学方法使待检的DNA变性成单链并固定在特定膜（硝酸纤维素膜）上，然后加入探针，在适当的条件下探针（用放射性同位素或荧光分子标记的含目的基因的单链DNA片段）与互补的目的基因片段形成双链。漂洗膜去除未互补结合的探针后，若出现杂交带，则可判断待检DNA中含有目的基因。
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