高中生物核心知识：目的基因筛选与获取

1.目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；主要是指编码蛋白质的基因。

温馨提示

①原核基因的结构：

编码区（能转录成mRNA，进而编码蛋白质的区段）：是连续的。

非编码区 （位于编码区的上游和下游，不能转录成mRNA，不能编码蛋白质）：其上有启动子（RNA聚合酶识别、结合的位点，驱动mRNA的转录）和终止子（当RNA聚合酶到达时，释放出mRNA，转录终止）。

②真核基因的结构：

非编码区：其上有启动子和终止子。

提醒:原核细胞没有剪切内含子的机制，真核基因有内含子，其转录出来的RNA序列不能被原核细胞加工切除，故真核基因导入原核细胞可能不能表达。以mRNA反转录成的cDNA就没有内含子，故cDNA可以在不同物种之间进行基因交流。

2.目的基因的筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选，是较为有效的方法之一。

提醒:随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank，可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息）、序列比对工具[如BLAST（基本局部比对搜索工具），是一种能对两个或多个序列（包括DNA序列和蛋白质序列）进行相似性比较，或将某个序列与序列数据库中的序列进行快速比对分析的工具]等的应用，越来越多的基因结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。

3.目的基因的获取方法

（1）利用PCR获取和扩增目的基因

①PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应，穆里斯等发明）：是在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

②原理：DNA半保留复制。

③需要的条件：

提醒:在几乎所有生物体内发现的DNA聚合酶都不能以单个脱氧核苷酸为起点，将游离的脱氧核苷酸从头聚合形成多核苷酸链，而只能将脱氧核苷酸掺入到一段已存在的核苷酸链（即引物）上。大多数生物，细胞内DNA复制的引物通常为6～8个碱基长度的单链RNA分子。PCR的引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，通常为20～30个核苷酸（小的DNA单链）。PCR反应需已知目的基因两端核苷酸序列设计两种引物，且两种引物之间不应存在互补序列，否则会相互结合形成引物二聚体，降低PCR的效率。(www.xing528.com)

④合成仪器：PCR仪。

PCR仪

⑤ 过程：高温变性→低温复性（退火）→中温延伸（目的基因DNA高温变性后解聚为单链；低温条件下，引物与单链相应互补序列之间形成氢键结合而复性；中温条件下，以单链DNA为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，如此重复循环多次，目的基因的量呈指数形式扩增）。

提醒:dNTP不仅为DNA复制提供原料，还可以水解为PCR反应提供能量，故不需要在反应体系中加入ATP供能。

⑥鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。

提醒:mRNA不能直接扩增，需要逆转录成cDNA（complementary DNA，互补DNA）才能扩增，这种PCR称为RT-PCR（反转录PCR）。

（2）构建基因文库来获取目的基因。

基因组文

cDNA文库

提醒:cDNA文库只含细胞已转录（已表达）的基因，基因组文库含生物的全部基因，因此cDNA文库比基因组文库小。由于基因的选择性表达，不同细胞构建出来的cDNA文库不同。基因组文库获取目的基因，操作简便，但工作量大，且具有一定的盲目性。目前，基因文库更多用于DNA测序。

（3）化学合成法：蛋白质的氨基酸序列→mRNA碱基序列→DNA（基因）的核苷酸（碱基）序列→DNA合成仪中合成。

温馨提示

①获取目的基因途径主要有两大途径：生物人工合成和从生物材料中分离。

②获取目的基因的方法主要是：PCR法、基因文库法、化学合成法。

③人工合成途径中，如果已知目的基因两端的部分序列，可以设计引物后，采用PCR扩增获取；如果已知目的基因的完整序列，可采用化学合成法获取，但该方法成本较高，适于合成序列较短的基因。