动物细胞培养:是指从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。
一、动物细胞培养的条件
1.营养条件:合成培养基+血清。
(1)合成培养基:将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。与细胞外液的营养物质基本相同的合成培养基,含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。
提醒:培养动物细胞一般使用液体培养基,也称为培养液。植物组织培养一般使用固体培养基。
(2)血清:含细胞所需而人们尚未完全研究清楚的营养物质。
2.无菌、无毒的环境
(1)无菌:培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下操作;添加适量的抗生素。
(2)无毒:定期更换培养液,以便清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
3.适宜的温度、pH和渗透压
(1)温度:哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5 ℃。
(2)pH:多数动物细胞生存的适宜pH为7.2~7.4。二氧化碳的含量会影响培养液的pH。
(3)渗透压:过高或过低影响动物细胞的代谢活动,甚至造成细胞死亡。
提醒:在细胞培养过程中,细胞代谢产物的积累、pH的调节、培养液的补充等,都会影响培养液的渗透压。加入渗透压保护剂,如甘氨酸、甜菜碱、脯氨酸和苏氨酸等,缓解培养液中渗透压改变对细胞生长的影响。
4.适宜的气体环境
(1)O2:细胞代谢所必需。
(2)CO2:维持培养液的pH。
提醒:在进行细胞培养时,通常采用培养皿或松盖培养瓶,并将它们置于含有95%空气加5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。95%的空气可以保证细胞呼吸对氧气的需要,恒定5%的CO2与培养基中的NaHCO3处于平衡状态,调节pH的相对稳定。
二、动物细胞培养的过程
1.原理:细胞增殖。
2.目的:获得细胞或细胞产物。
3.过程
温馨提示
①进行动物细胞培养时,一般选择动物的胚胎或幼龄动物的组织、器官。一般来说,分化程度越低的细胞,增殖能力越强,更容易培养,因此,幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。
②成块的组织需要分散成单个细胞的原因:细胞与细胞靠在一起,彼此限制了生长与增殖;有利于细胞对营养物质的吸收和代谢物的排出。
③使细胞分散开来,使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶,而不使用胃蛋白酶的原因是:多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4,而胃蛋白酶的适宜pH约为2,当pH大于6时,胃蛋白酶就会失去活性。
④胰蛋白酶处理消化处理时,处理的时间和加酶量要适宜,否则会导致细胞的其他蛋白质分解,从而对细胞造成损伤。
⑤细胞贴壁:细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上生长增殖的现象;培养瓶的表面要光滑、无毒,易于贴附。
⑥接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时(1层细胞),细胞通常会停止分裂增殖的现象。若要细胞继续增殖,就需要进行分瓶培养。正常细胞存在接触抑制现象,但癌细胞无接触抑制现象,可以形成多层细胞。(www.xing528.com)
⑦原代培养:通常将分瓶之前的细胞培养,即动物组织经处理后的初代培养称为原代培养。
⑧传代培养:将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
⑨分瓶前细胞的收集:悬浮培养的细胞直接用离心法收集;贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶处理,使之分散成单个细胞后,再用离心法收集。
⑩两次胰蛋白酶处理的目的:第一次处理的目的使组织细胞分散开;第二次传代培养时处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来,重新分散稀释成细胞悬液,便于分瓶后继续培养。
⑪通常使用的或冷冻保存的细胞是:10代以内的细胞,以保持细胞正常的二倍体核型,无遗传物质的改变。一般情况下,传代培养10~50次后,细胞增殖速度便会逐渐减缓,甚至完全停止,有些细胞可能还会发生癌变。
三、干细胞培养及其应用
1.干细胞的概念:动物和人体内,具有分裂和分化能力的细胞。
2.存在部位:早期胚胎、骨髓和脐带血等组织和器官中。
3.分类
(1)胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞):
①存在部位:早期胚胎中。
②特点:具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞,并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能,具有全能性。如ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
③局限性:胚胎干细胞必须从胚胎中获取,这涉及伦理问题,因而限制了它在医学上的应用。
(2)成体干细胞:
①概念:成体组织或器官内的干细胞。
②类型:骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等。
③特点:具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力。
④应用实例:
a.造血干细胞:治疗白血病、恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
b.神经干细胞:治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)。
4.诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS细胞)
(1)概念:像成纤维细胞等通过体外诱导,获得类似胚胎干细胞的一种细胞。
提醒:科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞,包括借助载体将特定基因导入细胞中、直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。
(2)应用:治疗小鼠的镰状细胞贫血;治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究取得了新进展。
(3)优点:无须破坏胚胎,不会产生伦理问题;iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞,将它移植回病人体内后,理论上可以避免免疫排斥反应,iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
提醒:iPS具有分裂活性,用它进行治疗时可能存在分化成肿瘤细胞的风险。
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