一、选择培养基
1.自然界中目的菌株的筛选
（1）原理：根据对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。
（2）实例：PCR所用的耐高温的DNA聚合酶，来源于热泉中的水生栖热菌（Thermus aquaticus）。
2.实验室中目的菌的筛选——选择培养基
（1）选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
（2）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
二、微生物的选择培养——稀释涂布平板法
取样→等比稀释→涂布平板（选择培养基）→恒温培养。
温馨提示
①涂布平板的所有操作都应在酒精灯火焰附近进行。
②设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。为排除培养基被杂菌污染，需要用未接种的培养基作为空白对照，如果未接种的培养基无菌落产生，说明培养基没有被污染，否则可能灭菌不合格，有杂菌污染。
③稀释可以将微生物分散开来，有利于分离得到单菌落。
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法 （间接数量测定）
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。
（2）减少实验误差的方法：
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
（3）计算公式：
每克样品中的菌落数=（C÷V）×M
其中：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
提醒:当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2.显微镜直接计数法
（1）原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
（2）优点：快速直观。
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
温馨提示
①如果计数前用台盼蓝染液染色，可以统计无色细胞的个体数来对活菌进行计数。
②血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板用于对细菌等较小的细胞进行观察和计数。二者计数的原理相同。
四、实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.实验原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
选择培养基
作为对照，可以判断选择培养基是否起到了选择作用。(www.xing528.com)
提醒:KH2PO4、Na2HPO4既提供无机盐，又作为缓冲剂，维持培养基的pH相对稳定。
2.实验步骤
（1）土壤取样：找到酸碱度接近中性的潮湿土壤，铲去表层土，选择距地表3～8 cm的土壤层。
（2）样品稀释：测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
温馨提示
①不是所有的细菌检测培养都需要进行梯度稀释。如：符合国家标准的自来水中大肠杆菌数目本身就非常少，如果进行梯度稀释，最后培养出来的菌落数可能不在计数要求的范围内，从而导致结果误差大。
②样品的稀释度会影响平板上生长的菌落数目，不同的微生物，要采用不同的稀释度。如果得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，能够进行菌落的计数。
③在同一稀释度下，应该至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值。
（3）培养和观察：每个稀释倍数的稀释液涂布到3个选择培养基（以尿素为唯一氮源的培养基）上、1个牛肉膏蛋白胨培养基上；在30～37℃的温度下培养1～2 d，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
（4）菌种的鉴定（了解）：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，分解尿素的细菌合成脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，会使指示剂变红。
温馨提示
①如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
②实验中将稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）上作为对照，可以判断培养基是否起到了选择作用，如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基起到了选择作用，筛选了一些尿素分解菌。
③在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作中可能出现了错误，因此不能简单地将3个平板计数值用来求平均值。
④不同微生物的培养温度不同：细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d；放线菌一般在25～28 ℃的温度下培养5～7 d；霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 d。
⑤两种接种方法比较：
⑥平板划线法和稀释涂布平板法都是为了使聚集的菌种分散成单个细胞，以便得到纯化的菌落。稀释涂布平板法除可以分离微生物外，还可以计数样品中活菌的数目。平板划线法不能用于测定菌体的数目，原因主要是许多菌落并不是由单个菌体形成的。
⑦菌落特征包括菌落的形状、大小、颜色等方面。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，因此，菌落特征是鉴定菌种的重要依据。
⑧原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步验证。
五、实验拓展：分解纤维素的微生物的分离（了解）
1.纤维素与纤维素酶
（1）纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
（2）纤维素酶：一种复合酶，一般认为它至少包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。
2.纤维素分解菌的筛选
（1）原理：刚果红（Congo Red，简称CR）能与培养基中的纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖反应。当纤维素被纤维素酶分解后，该红色复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。透明圈的大小反映出分解菌的分解能力，即透明圈越大，分解菌的分解能力越强。
（2）方法：刚果红染色法。常用的有两种方法：
①方法一（传统方法）：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。
②方法二：倒平板时就加入刚果红。
3.实验设计
（1）土壤取样：在富含纤维素的潮湿土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土样并装入无菌信封，密封。
（2）选择培养（该步可以省略）：将样品接种到以纤维素粉为碳源的选择培养基上培养，以增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离出所需要的微生物。
提醒:选择培养能够“浓缩”所需微生物的原因：在选择培养条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，从而可以起到“浓缩”的作用。
（3）梯度稀释：用无菌吸管吸取1 mL培养液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使两者充分混匀；用另一支1 mL无菌吸管从此管吸1 mL菌液注入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，配制成101、102、103、104、105、106倍的各种稀释液。
（4）涂布培养：将各稀释度的菌液涂布到培养基上，做好标记后，放入恒温箱中培养一段时间。
提醒:分离培养微生物的一般方法：土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将菌悬液涂布到有选择作用的培养基上→挑选单菌落→发酵培养。
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