蛋白质组学研究方法实现《现代营养学》

因为蛋白质组技术能在特定的条件下规模化地考察基因和蛋白质的表达情况，为生物标志物的发现、鉴定和评价提供了有力的技术平台。但是，由于构成蛋白质的氨基酸残基数量多，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化等，因此蛋白质的分离、分析技术更为复杂。目前，双向电泳技术、质谱技术以及计算机图像分析与大规模数据处理技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

1.蛋白质组的分离技术　蛋白质组研究要解决的首要问题是如何实现对细胞、组织或体液所含有的成千上万个蛋白质的有效分离。分离技术是蛋白质组学研究中的核心，双向凝胶电泳技术（twodimensional gel eletrophoresis，2-DGE）是分离复杂蛋白质复合物的首选技术，具有较高的分辨率，并且能够和质谱技术联用，实现分析蛋白质的目的。在2-DGE中，蛋白质首先根据等电点的不同在第一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被进一步分离。20世纪80年代初出现的固相化pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳技术，大大提高了2-DGE的重复性，同时减少了上样量。使用2-DGE技术可以分辨混合蛋白质，同时分析成百甚至上千种基因产物。然而，并不是所有的蛋白质都可以通过2-DGE技术得到很好的分离。对极碱性、疏水性、膜结合蛋白以及高分子量蛋白质的分离仍然存在困难。在某些情况下，有必要首先采用传统分离方法根据细胞部位（如膜、微粒体、细胞溶质、线粒体）或者蛋白质溶解性进行预分离。此外，某些细胞内含量很低的蛋白质，尽管其在细胞内功能很重要，如存在于信号通路中，但是在大量管家蛋白存在的情况下却很难被分离出来，因此还需要不断完善开发新的分析技术。

2.蛋白质组的鉴定技术　蛋白质的鉴定是蛋白质组学技术的支柱，是肽图谱或指纹图谱分析主要采用的方法，主要技术包括质谱技术（mass spectrometry）、蛋白质芯片技术、蛋白质信息组学、酵母双杂交系统（yeast two hydrid system）、噬菌体展示技术和核素编码亲和标签技术（isotope coded affinitytages，ICAT）。

（1）质谱技术：目前蛋白质鉴定方法中发展最快、最具潜力的技术，具有高灵敏度、高准确性、自动化等特点。该方法是建立在质谱电离技术-基质辅助激光解析电离（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）的发展和成熟基础上。以MALDI为基础的肽质指纹（peptide mass finger print，PMF）、源后衰变（post-scource decay，PSD）片段离子分析和以ESI为基础的串联质谱（Tandem-MS）的部分测序技术等，已经成为质谱鉴定蛋白质的主要方法。新近出现的一种被称为基质辅助激光解析电离四级飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS），由于这种技术综合了肽指纹图谱方法的大规模、高通量和串联质谱能直接获得肽序列两方面的优点，因而可用于测定蛋白质或多肽的精确相对分子质量，并能测定较大分子的相对分子质量。

质谱分离结果通常需采用计算机软件，运用数学运算方法来解释肽图谱模式，并通过与已经明确的特定基因组开放阅读框进行比较来预测蛋白质。蛋白质的翻译后修饰作用如添加磷酸基团、赖氨酸或脯氨酸残基羟基化、糖基化，或添加脂肪酸等，也可以采用片段分析和结构的飞行质谱（FAST）或其他方法分析。

（2）蛋白质芯片技术：蛋白质芯片（protein array）是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”（即蛋白质与蛋白质之间，如抗体与抗原在空间构象上能进行特异性的相互识别），再通过自动化仪器分析得出结果。主要用于蛋白质间相互作用和差异显示蛋白质组的研究，在高密度的方格上含有各种微量纯化的蛋白质，并能够高通量地测定这些蛋白质的生物活性，以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用。(www.xing528.com)

（3）蛋白质信息组学：在蛋白质组分析中起着重要作用，是蛋白质组学研究水平的标志和基础。蛋白质组数据库被认为是蛋白质组学知识的储存库，包含所有鉴定的蛋白质信息，如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、双向凝胶电泳、三维结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等。

（4）酵母双杂交系统：一种用于蛋白质间相互作用研究的工具，其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报告基因的启动子，能够启动报告基因在酵母细胞内的表达，通过检测报告基因表达产物，反过来可以判别诱饵蛋白和靶蛋白之间是否存在相互作用。如果检测到报告基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用；如果未检测到，则说明两者之间无相互作用。

（5）噬菌体展示技术：一种研究蛋白质间相互作用的技术。方法是在编码噬菌体外壳蛋白质基因上连接一个单克隆抗体的基因序列。噬菌体生长时，表面就表达出相应的单克隆抗体。将噬菌体过柱，柱上若含有目的蛋白，会特异性结合相应抗体。

要注意的是，蛋白质组学分析方式是一种简单直接的分析方法，例如要分析某一种治疗手段的作用，应该利用培养细胞或细胞株进行试验，所分析的是同种类细胞。而如果利用组织样本，由于不同细胞群的蛋白质表达谱不同，蛋白质组分析就变得尤为困难，通常还需要利用细胞特异性表面标志物和免疫亲和技术，或者激光驱动显微解剖技术分离不同细胞群。今后更为简便的蛋白质组分析方法应该是利用抗体库，该库中包括与任何开放阅读框作用的特异性抗体，从而形成蛋白质组的高通量微孔板分析方法，该方法能从根本上鉴定每一种蛋白质，并能方便进行定量。