（一）核酸检测
手足口病是由肠道病毒感染引起的一种儿童常见传染病，5岁以下儿童多发。引起手足口病最常见的是柯萨奇病毒A16型及肠道病毒71型。最早被发现手足口病的病原体是柯萨奇病毒，手足口病与EV71感染有关的报道则始自20世纪70年代初，1972年EV71在美国被首次确认。此后，EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。近几年来，手足口病广泛流行于亚太地区，泰国、日本、澳大利亚、马来西亚、新加坡、韩国、越南、中国大陆等先后都报道了手足口病毒的流行情况。
历史上记载发生手足口病最多的国家是日本，有过多次大规模的流行。自从1970年发生流行以后，手足口病在日本几乎每隔2～3年就有可能发生1次流行。
1997年以后，马来西亚、新加坡等地发生大规模流行和暴发的手足口病均以EV71感染引起，死亡的患者主要以中枢神经系统感染导致。1987年中国香港地区发生过由EV71感染引起的手足口病，2001年出现了首例患者死亡，是1名2岁男童出现的肺水肿、肺出血引起。1998年中国台湾地区由EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，共发生129106例患者，其中出现严重中枢神经系统感染症状患者405例，死亡78例，以5岁以下幼儿居多，多以脑干脑炎为主。此后，台湾每年都有由EV71引起的手足口病的小规模流行。
在20世纪80—90年代中国大陆地区流行的手足口病原体以柯萨奇16型为主，自1981年上海报道了罕见的手足口病之后，北京、天津、福建、湖北、山东、广东等十几个省市均有报道。1983年天津暴发的手足口病均由柯萨奇16型引起，5—10月共发现了7000多例患者。散发于2年后，1986年再次暴发，发生在幼儿园和托儿所的2起发病率分别达2.3%和1.9%，这是我国首次报告的较大规模的手足口病暴发疫情。2008年安徽省阜阳市手足口病疫情暴发，共发生4496例患者，其中有22例死亡，均由EV71感染引起。自2008年以来，中国内地很多地区出现手足口病的局部暴发，均由EV71和柯萨奇16型引起，但2种病毒的血清型分布在不同的地方。手足口重症和死亡患者的病原构成以EV71占比最大。根据卫计委的报道，我国2007年共有手足口病患者83344例，其中17例死亡；2008年共有手足口病患者488955例，其中126例死亡；2009年共报告手足口病患者1155525例，有353例死亡；2010年共报告手足口病患者1795336例，有888例死亡，流行呈逐年增加的趋势。
手足口病由人肠道病毒（HEV）引起。HEV属于小核糖核酸病毒科、肠病毒属，包括柯萨奇病毒（CV）、埃可病毒（ECHO）及肠道病毒71型（EV71）等。肠道病毒呈球形，核衣壳呈二十面体立体外观，无包膜，直径28～30nm。病毒衣壳由60个相同壳粒组成，排列为12个五聚体，每个壳粒由VP1、VP2、VP3和VP4四种多肽组成。手足口病毒基因组为单股正链RNA，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常高，中间为连续开放读码框。
手足口病的早期诊断：手足口病是一种自限性疾病，绝大多数病例1周内痊愈，但由于EV71感染少数患儿可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。重症病例的早期诊断至关重要。与传统的抗体检测相比，肠道病毒核酸检测更灵敏、准确，有助于手足口病患儿，尤其重症患儿的早期诊断及尽早治疗，不仅能够阻断和延缓病情进展，也能加强治疗力度，对于防治中枢神经系统并发症、改善预后和降低病死率意义重大。EV71核酸检测虽然可明确病因，但诊断重症病例仍需严密观察病情，主要依据临床表现确定重症病例，而不能单纯依据辅助检查。手足口病易在集体和幼儿园中传播，多为患儿及隐性感染者咽喉液及唾液中的病毒以飞沫形式感染，患儿的疱疹液及粪便中的病毒亦可经手或借助被污染的物品经口传染。肠道病毒核酸检测有利于及早发现患者，及时有效隔离，避免手足口病的大规模暴发。
1.临床诊断（流行病学资料）
（1）传染源
患儿和病毒携带者是重要的传染源，手足口病大多数为隐形感染者。对于肠道病毒来说，由于它们所处的环境属于湿润且温度适宜的环境下，这些病毒非常容易生存，并且通过感染者的粪便和分泌物来进行人与人之间的相互传播过程。
（2）传播途径
粪-口是主要的传播途径，偶然也可以通过飞沫传播。这些病毒的主要传播途径是通过五岁左右孩童的口腔和他们食用了受污染的食物和水等感染的，有些孩子通过接触带有污染的玩具和碗筷等物品，都会被该病毒所感染。
在孩子活动的环境里面一定要勤消毒，孩子们能接触的物品，特别是餐具和自己的清洁工具一定要避免病毒的出现。
（3）易感人群
婴幼儿普遍容易感染，以5岁以内孩童为主，免疫力低下的成人也可感染手足口病毒。
2.临床表现
（1）脑炎、脑膜炎
对于手足口病的相关患者，都会出现脑炎或者脑膜炎等现状表现，他们通常表现为精神力较差，而且非常喜欢睡觉，浑身乏力且头晕，会产生呕吐等现象。
（2）循环衰竭
这些患者主要表现为呼吸节奏较快，心律不齐，容易出现冷汗以及四肢发凉等情况，而且对于早期的患者会伴随着血压的相应上升，而后期则又会出现一些窒息情况的发生。
（3）神经源性肺水肿
患者会出现嘴唇发紫，甚至会咳出一些像血液一样的液体物质，而心肌炎主要是由于病毒感染所引起的症状，相关患者有时还会出现胸闷胸痛等一系列心脑血管疾病的性状，表现严重的患者还会出现休克等。
3.实验室检测
（1）原 理
选用CA16、EV71及肠道通用病毒保守基因片段设计特异引物及特异探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5＇端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3＇端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激从而发出可供仪器检测的荧光，因此实现在全封闭反应体系中对CA6、EV71及肠道通用病毒核酸的自动化检测。
（2）试剂仪器和操作
适用标本类型为咽拭子、疱疹液、粪便等，其余参考所使用的特定试剂盒说明书。手足口实时荧光检测试剂包括标本处理试剂、核酸扩增试剂和质控品。所用仪器为实时荧光PCR扩增仪。
（3）操作步骤
不同试剂盒RT-PCR操作及反应流程不同，具体操作以说明书为准，本文以两步法RTPCR为例。
①总RNA提取：按试剂说明提取细胞总RNA，制备模板RNA。
②逆转录合成cDNA：根据AMV逆转录酶生产厂说明书，通过逆转录合成与目的基因RNA序列互补的cDNA。
③配置反应体系：不同试剂盒配置体系不同，以说明书为参考。
④PCR扩增：PCR循环特异性扩增目的基因片度，反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共扩增30～35个循环；最后72℃延伸10min。
（4）质量控制措施
①阴性对照：无典型S形扩增曲线；
②阳性对照：呈典型S形扩增曲线且Ct值＜37；设立内标，选用一对管家基因特异性引物，结合特异性探针，从而实现在全封闭反应体系中对检测过程的监控，检测样本的Ct值应＜40。
（5）结果判读标准
在满足以上质量控制条件下，进行如下分析：
以某厂家EV71型、CA16、通用型肠道病毒RNA检测试剂盒为例。
CY5通道：
①阳性：待测样本结果Ct≤37，曲线呈S形且有明显指数增长期，判断为EU病毒阳性；
②重复检测：待测样本检测结果37＜Ct≤40，此时样本应进行重复检测，如结果Ct仍在37～40范围内，曲线呈S形且有明显指数增长期，则判断为EU病毒阳性，否则判断为EU病毒阴性。
③阴性：在Ct＞40或未检出，此次结果判断为EU病毒阴性。
FAM通道：
①阳性：待测样本结果Ct≤37，曲线呈S形且有明显指数增长期，判断为CA16病毒阳性；
②重复检测：待测样本检测结果37＜Ct≤40，此时样本应进行重复检测，如结果Ct仍在37～40范围内，曲线呈S形且有明显指数增长期，则判断为CA16病毒阳性，否则判断为CA16病毒阴性。
③阴性：在Ct＞40或未检出，此次结果判断为CA16病毒阴性。
VIC通道：
①阳性：待测样本结果Ct≤37，曲线呈S形且有明显指数增长期，判断为EV71病毒阳性；
②重复检测：待测样本检测结果37＜Ct≤40，此时样本应进行重复检测，如结果Ct仍在37～40范围内，曲线呈S形且有明显指数增长期，则判断为EV71病毒阳性，否则判断为EV71病毒阴性。
③阴性：在Ct＞40或未检出，此次结果判断为EV71病毒阴性。
（二）免疫学检测(www.xing528.com)
1.ELISA检测柯萨奇病毒抗体IgM
手足口病原体以人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型最为常见，多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高。患者和隐性感染者均为传染源，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播。主要症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹。少数病例可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿和循环障碍等，多由EV71感染引起，致死原因主要为脑干脑炎及神经源性肺水肿。
实验室常用ELISA、中和试验等进行柯萨奇病毒抗体检测，采用双抗原一步夹心法可检测特异IgM抗体，对本病有早期诊断价值。急性柯萨奇病毒感染可以通过特异性IgM抗体和（或）IgA抗体检测及IgG抗体滴定度上升证实。除了6个月以下的婴儿以外，各年龄组都可以进行IgM抗体检测。IgM阳性血清检出率最高的是1～10岁年龄段。一般可以在6～8周以上的时间内检出IgM抗体。极少情况下，IgM可以在无菌性脑膜炎后维持6个月。如果是心肌炎或心包炎，3～6个月可以找到IgM抗体，如果是流行性胸肌痛，可长达1～2个月。柯萨奇病毒感染引起的反复发作的心包炎患者IgM抗体可能维持约5年。
（1）原 理
采用双抗原一步夹心法。向预先包被人柯萨奇病毒抗原的包被微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测抗原，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下检测吸光度（OD值），与cut-off值相比较，从而判定标本中人柯萨奇病毒抗体的存在与否。
（2）试 剂
试剂盒组成：①微孔板（表面包被有人柯萨奇病毒抗原）；②标本稀释液；③洗涤缓冲液（20倍浓缩）；④底物A、B；⑤酶标记物；⑥阴性对照；⑦阳性对照；⑧终止液；⑨封板膜等。
（3）操 作
按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：设定和加载阴性对照、阳性对照、质控物和待测样本→温育反应一洗涤→加入酶标记抗原→温育反应→洗涤→加入酶底物显色溶液→温育反应→终止→比色。
（4）结果判定
按特定试剂盒说明书进行。例如，①试验有效性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；阴性对照孔OD值平均值≤0.15。②cuo值计算：cutoff值=阴性对照孔平均值+0.15。③阴性判断：样品OD值＜cutoff值，样品为阴性。④阳性判断：样品OD值≥cutoff值，样品为阳性。
（5）参考区间
未感染柯萨奇病毒者，血清抗柯萨奇病毒抗体阴性。
2.ELSA检测EV71抗体IGM
EV71导致的手足口病较常引起中枢神经系统损伤，重症患者比例及病死率均明显高于其他肠道病毒。肠道病毒71型IgM抗体主要存在于EV71感染急性期，IgM抗体可用于EV71早期感染的辅助诊断，不作为临床诊断的唯一依据。检测的阳性反应结果必须结合临床信息进行分析。IgM抗体阳性反应不仅发生在原发感染，在继发感染亦可见IgM反应性升高。检测的阴性结果并不完全排除EV71感染的可能。EV71感染初期IgM抗体未产生或滴度很低；免疫功能受损或接受免疫抑制治疗的患者，其血清学抗体含量水平有限；以及ELSA检测灵敏度的限制；都可能造成以上结果，建议患者在7～14天内复查，复查时平行检测上次采集的标本以确定是否出现血清学阳转或者滴度明显升高。
（1）原 理
采用捕获法。微孔条上预包被的抗人IgM（抗μ链）可与样品中的IgM抗体结合，洗板后加入抗原试剂与酶标试剂进行二次孵育。当样品中存在EV71-IgM抗体时，将形成“抗μ链-IgM抗体-抗原-酶标抗体”复合物。复合物上连接的HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色。若样品中无EV71-IgM抗体时，不显色。
（2）试 剂
试剂组成：包被抗人IgM（抗μ链）的微孔板、酶标记的抗体、酶底物显色溶液以及阴性对照、阳性对照、样本稀释液、浓缩洗涤液。
（3）操 作
按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：设定和加载阴性对照、阳性对照、质控物和待测样本→温育反应→洗涤→加入酶标抗原→温育反应→洗涤→加入酶底物显色溶液→温育反应→终止→比色。
因不同试剂盒操作方法及流程不同，具体操作按照其试剂说明书进行，以ELISA通用操作为例，检测步骤如下：
①试剂室温平衡30min以上；
③编号：将标本对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔；
④加稀释液：每孔加入标本稀释液100μL，空白孔除外；
⑤加样：分别在相应孔中加入待测标本或阴性、阳性对照10μL，轻轻振荡混匀（脑脊液可以1:2稀释）；
⑥孵育：用封板膜封板后，37℃孵育30min；
⑦洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次扣干；
⑧加抗原：每孔加入抗原试剂50μL，空白孔除外；
⑨加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻振荡混匀；
⑩孵育：用封板膜封板后，37℃孵育30min；
⑪洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次扣干；
⑫显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min；
⑬测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10min内测定结果，设定酶标仪波长于450nm，用空白孔调零后测定各孔OD值。
（4）结果判定
按特定试剂盒说明书进行。标本OD值≥临界值，为EV71IgM抗体阳性；标本OD值＜临界值，为EV71IgM抗体阴性。
（5）参考区间
未感染肠道病毒EV71者，血清抗肠道病毒EV71型IgM抗体阴性。
3.间接免疫荧光法检测EV71抗体
（1）原 理
以感染EV71病毒的RD细胞（用冷丙酮固定）作为抗原片，于其上滴加一定稀释度的待测血清，如血清中有抗EV71病毒抗体存在，即可与感染细胞中的EV71病毒蛋白结合形成抗原-抗体复合物。经充分洗涤除去未结合物后，再加异硫氰酸荧光素（FC）标记的抗人IgG（或抗人IgM）抗体于抗原片上，形成EV71病毒抗原-患者血清中的抗EV71病毒抗-体荧光素标记的抗人IgM复合物，经充分洗涤后在荧光显微镜下观察，可见胞质内呈现典型荧光。
（2）试 剂
包括感染EV71病毒的RD细胞抗原片、异硫氰酸荧光素（FTTC）标记的抗人IgG（或抗人IgM）、阳性和阴性对照、PBS吐温缓冲液和封片介质等。
（3）操 作
按试剂盒所附的使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作过程如下：加载样本→样本固定→加荧光抗体→温育反应→洗涤→封片→观察结果。
（4）结果判定
根据EV71病毒感染细胞荧光强度判定结果。抗体强度1+～4+为阳性反应；抗体强度-～±为阴性。以待测血清出现阳性结果的最高稀释度为抗EV71病毒抗体滴度。
（5）参考区间
未感染肠道病毒EV71者，血清1:20稀释抗EV71病毒抗体阴性。
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