（一）核酸检测
结核（TB）是一种由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，这种疾病通常影响肺部（肺结核病），但也可能影响其他部位（肺外结核病）。该病的病变主要有干酪样变、空洞产生、结核结节和炎性浸润等。2014年和2015年，世卫组织和联合国的所有成员国承诺通过世卫组织的《结束结核病战略》和联合国可持续发展目标来结束结核病流行。该战略和可持续发展目标是：大幅降低结核病发病率、结核病死亡人数和结核病患者及其家庭面临的巨大成本。然而，根据世界卫生组织的数据，在全球范围内，2019年大约有1000万人感染结核病，全球负担最大的三个国家分别是印度（27%）、中国（14%）和俄罗斯（8%）。从地理位置上看，感染结核病的大多数人在东南亚地区（44%）、非洲地区（25%）和西太平洋地区（18%）。我国是结核病高负担国家，不仅活动性结核患者数量多，潜伏性结核感染（LTBI）者基数也庞大，中国的LTBI负担是世界上最高的，约有3.5亿人。潜伏性感染者如不进行治疗，约有5%～10%会发展成活动性结核病，并成为新的传染源，造成结核病的进一步传播。我国要实现WHO提出的“终止结核病战略”，任重道远。
结核分枝杆菌（MTB），简称结核杆菌，属分枝杆菌科、分枝杆菌属，是引起结核病的病原菌。德国著名医学家、细菌学家罗伯特·科赫于1882年最早发现结核分枝杆菌，并证明该菌为人类结核病的病原菌，结核分枝杆菌可侵犯全身各器官，但以肺结核最为常见。
结核分枝杆菌细长而稍弯，两端微钝，但痰液样本中的结核分枝杆菌也可表现为棒状、丝状、“Y"字形、“V”字形等多种形态。结核分枝杆菌为专性需氧菌，最适宜生长温度为37℃，最适宜pH为6.5～6.8，结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢，其增代时间为14～20h。常用培养基为罗氏培养基，在固体培养基上一般培养2～4周后，形成的菌落常为菜花样，在液体培养基上培养，可有菌膜产生。结核杆菌经抗酸染色后为红色，由于其对盐酸酒精的脱色有一定的抵抗，故称之为抗酸杆菌。结核分枝杆菌耐酸、耐碱，对干燥和寒冷有很强的抵抗性。黏附于尘埃中仍然能保持8～10d的传染性，在干燥痰液中可以存活6～8个月。对湿热比较敏感，60℃30min即失去活性。结核杆菌对乙醇极为敏感，在75%的酒精中2min死亡。结核分枝杆菌的致病力、形态和药物敏感性在一定条件下，均能发生变异。
结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组由4411529bp组成，包括4000多个基因，G+C含量为65%，包括约4000个编码基因。现已确定约40%编码蛋白质基因功能清楚，44%编码蛋白质基因功能部分清楚，剩余16%编码蛋白基因功能不清楚，可能是分枝杆菌特有的功能基因。结核杆菌基因组的特征之一是9%基因组编码2个富含甘氨酸蛋白质新家族，即富含甘氨酸、丙氨酸新的蛋白家族和富含甘氨酸天冬氨酸的新的蛋白家族。这些蛋白的功能与结核杆菌抗原变异、逃避免疫有关。另一个特征是有大量编码脂肪酸代谢酶的基因，大肠埃希菌仅有50个，而结核杆菌有250个编码脂肪酸代谢酶的基因。结核杆菌有FASⅠ和FASⅡ两种脂肪酸合成酶系统。FASⅡ型系统可合成蜡样的结核菌醇二分枝菌酸，它是一种致病分枝杆菌细胞壁上含量丰富的特有成分。
结核分枝杆菌因其培养周期长，临床很难采用培养方法进行TB感染的快速检测，而采用PCR法可以做到这一点。如通过对痰、血液、淋巴液、脑脊液、胸腹水等标本中TB的PCR检测，快速诊断肺结核、结核杆菌血症、淋巴结核、结核性脑膜炎、结核性胸腹膜炎。结核杆菌DNA检测有助于TB感染的早期诊断，尤其对于因菌量少，或结核菌发生L型变异而不易分离培养成功的标本更具有实用价值。此外，一定比例涂片或培养阴性的患者，PCR检测可为阳性。在抗结核治疗中，采用PCR定期检测，可用于抗结核药物疗效的评价。
1.临床诊断（流行病学资料）
（1）传染源
结核病的传染源主要是痰涂片或培养阳性的肺结核患者，其中尤以涂阳肺结核的传染性为强。
图3-55 结核分枝杆菌
图3-56 基因相关
（2）传播途径
结核菌主要通过呼吸道传染，活动性肺结核患者咳嗽、打喷嚏或大声说话时，会形成以单个结核菌为核心的飞沫核悬浮于空气中，从而感染新的宿主。此外，患者咳嗽排出的结核菌干燥后附着在尘土上，形成带菌尘埃，亦可侵入人体形成感染。经消化道、泌尿生殖系统、皮肤的传播极少见。
（3）易感人群
糖尿病、矽肺、肿瘤、器官移植、长期使用免疫抑制药物或者皮质激素者易伴发结核病，生活贫困、居住条件差以及营养不良是经济落后社会中人群结核病高发的原因。越来越多的证据表明，除病原体、环境和社会经济等因素外，宿主遗传因素在结核病的发生发展中扮演着重要角色，个体对结核病易感性或抗性的差异与宿主某些基因相关。
2.临床表现
（1）全身症状
结核患者常有一些结核中毒症状，其中以发热最常见，一般为午后37.4℃至38℃的低热，可持续数周，热型不规则，部分患者伴有脸颊、手心、脚心潮热感。急性血行播散性肺结核、干酪性肺炎、空洞形成或伴有肺部感染时等可表现为高热。夜间盗汗亦是结核患者常见的中毒症状，表现为熟睡时出汗，几乎湿透衣服，觉醒后汗止，常发生于体虚病人。其他全身症状还有疲乏无力、消瘦、失眠、月经失调甚至闭经等。
（2）呼吸系统症状
主要表现为：咳嗽、咳痰、咯血和胸痛等。咳嗽是肺结核的常见症状，一般咳嗽轻微、干咳或少量黏液痰，继发细菌感染时痰呈脓性。肺结核患者可有不同程度的咯血。当炎症波及壁层胸膜时，相应胸壁有刺痛，一般并不剧烈，可随呼吸和咳嗽加重。肺实变范围广或干酪性肺炎者有胸部叩诊浊音、支气管呼吸音、细湿啰音等体征。支气管结核可有刺激性呛咳局限性哮鸣。慢性空洞性肺结核患侧胸廓下陷、肋间变窄、气管和纵隔移位。渗出性胸膜炎常有发热、胸痛、咳嗽等；大量积液者呼吸困难，呼吸运动受限，胸部语颤及呼吸音减弱或消失等。
3.实验室检测
（1）原 理
采用实时荧光PCR技术原理，选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合。在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5'端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3'端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，实现在全封闭反应体系中对结核分枝杆菌核酸的自动化检测。
（2）主要仪器及试剂（以某试剂盒为例）
①仪器：扩增检测仪器为具有FAM和HEX/VIC荧光通道的ABI7500荧光PCR扩增仪或西安天隆公司的天隆TL988-IV四通道荧光定量PCR扩增仪，天隆核酸提取仪。
②试剂：结核杆菌反应混合液、Taq酶、核酸提取液、阳性对照、阴性对照。
（3）操作流程
①在待测痰液中加入4倍体积的4%氢氧化钠，混匀，室温下放置30min至1h使其充分液化。
②取1mL液化样本13000rmp离心10min。
③去上清，加1mL生理盐水，混匀。
④加200uL液体至核酸提取板，放入提取仪，提取核酸。
⑤配制试剂：结核分枝杆菌复合群反应液35.2uL、Taq酶0.8uL，按总体积36uL量分装到PCR薄壁管中。
⑥按顺序在每个薄壁管中加入4uL待测核酸模板、阴性与阳性质控，盖紧反应管，转移扩增区。
⑦将各反应管按顺序放入荧光定量PCR扩增仪上进行扩增。
（4）结果判定
FAM通道检测Ct值小于或等于38.0时，则该样本为结核分枝杆菌复合群阳性。
（5）参考区间
阴性。
（6）注意事项
①尽量选取非血性的样本。
②对于痰性样本一定要充分液化。
③各区物品均为专用，不得交换使用，避免污染，每次实验完后立即清洁工作台。
④扩增完毕请立即取出反应管，密闭在专用塑料袋中，放于指定地点，等待统一处理。
⑤PCR检测是病原体核酸，不管TB是否为活细菌，PCR均能检出，因此在经抗生素治疗一个疗程后，必须两周后才能做PCR检测，以避免临床假阳性。
（7）临床意义
①结核杆菌培养周期过长，在临床上，无法通过培养的方式来对结核杆菌进行快速测定，但PCR法可以快速测定结核杆菌。
②TB DNA检测对于TB感染的早期诊断有很高的价值，特别对于由于菌量少，或L型变异的结核菌而不易分离培养成功的标本更具有实用价值。
③通过对结核分枝杆菌DNA的定期检测，可用于评价抗结核药的疗效。
（8）质量控制
试剂只可反复冻融三次，在室温条件下试剂放置时间不超过8h。痰液样本如不能及时处理，2～8℃保存，不超过24h。
（二）免疫学检测
结核分枝杆菌免疫检测方法主要是酶免疫分析，包括斑点免疫胶体金渗滤试验（DIGFA）、斑点免疫层析技术（DICA）和ELSA等。
1.斑点免疫胶体金渗滤试验
（1）原 理
将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维素膜上，膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核分枝杆菌IgG抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体标记物结合后显色（SPA能与IgG特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现斑点即可判断阴、阳性结果，从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。
（2）试 剂
采用专用商品试剂盒，试剂盒主要包括反应板、封闭液、洗涤液、金标液、阴性和阳性对照。
（3）操 作
按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要过程如下：滴加封闭液→加载血清→加洗涤液→加金标液→加洗涤液→观察结果。
（4）结果判定
阳性反应：质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现；阴性：质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹。
（5）参考区间
未感染过及未接种结核分枝杆菌疫苗者，血清抗结核分枝杆菌抗体阴性。
（6）注意事项
①试剂在有效期内使用，不同批号试剂盒中的试剂组分不能混用。
②滴瓶溶液使用后应立即旋紧瓶盖，尽量避免与外界空气接触，以保证溶液免受污染。
③质控点显示红色表明试剂盒有效；阴性、阳性对照确保定性结果可靠的环节，但临床阳性标本显示深浅可以与阳性对照不同。
④血清属潜在生物危害物质，操作者应戴手套，测试后，凡接触血清的物品应消毒后丢弃。
2.ELISA法
（1）原 理
采用间接法进行。以结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）或细胞壁成分阿拉伯甘露聚糖脂（LAM）或重组的特异性蛋白质抗原包被聚苯乙烯微孔板，封闭空白位点后，加入稀释的待测血清，如果待测血清中含抗结核分枝杆菌抗体，则可以与固相抗原结合。洗去未反应物，加入酶标抗人IgG抗体温育，进一步形成固相抗原-抗结核分枝杆菌抗体-酶标抗人IgG复合物，充分洗涤后加入酶底物/色原产生颜色反应，呈色程度与抗结核分枝杆菌抗体的水平成正比。
（2）试 剂
采用专用商品试剂盒，试剂盒主要包括反应板、封闭液、洗涤液、金标液、阴性和阳性对照。
（3）操 作
按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要过程如下：加载血清（待测血清、阳性与阴性对照）→温育→洗板→加入HRP标记的抗人IgG抗体→温育→洗板→加入酶底物显色溶液→观察结果。
（4）结果判定
以待测血清与cut-off吸光度比值（S/CO）≥1判为阳性反应。
（5）参考区间
未感染过及未接种结核分枝杆菌疫苗者，血清抗结核分枝杆菌抗体阴性。
（6）临床意义
抗结核分枝杆菌抗体检测的特异性取决于所包被抗原的特异性。采用PPD做抗原，活动性肺结核患者中抗体检出率60%～80%，特异性接近90%。阿拉伯甘露聚糖脂（LAM）、相对分子量为38kD、30kD和16kD的蛋白质为靶抗原，其抗体在活动性肺结核患者中检测敏感性为82%～89.7%，特异性为95.7%～97.5%。以结核分枝杆菌早期分泌靶抗原6和培养滤液蛋白10为靶抗原，其抗体的临床意义尚需进一步评估。除血清标本外，脑脊液、胸腹水、尿液、支气管肺泡灌洗液等体液均可用于检测结核分枝杆菌抗体。需注意的是，非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌感染也可呈阳性反应。(www.xing528.com)
3.结核杆菌感染T细胞检测
（1）检验方法
原理：人体感染了结核菌之后，会产生特异性的效应T淋巴细胞，当再次受到结核抗原刺激后，这种T淋巴细胞就会产生多种细胞因子，如IFN-γ。用两种结核抗原（ESAT-6，CFP10）刺激淋巴细胞，然后用抗体捕获细胞分泌出来的细胞因子，并将其染色后显示出来。每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T细胞数量。
（2）主要仪器与试剂
仪器：温育箱
试剂：结核杆菌特异混合多肽A、结核杆菌特异混合多肽B、微孔培养板、浓缩标记抗体、阳性质控、显色底物溶液。
（3）操作流程
①将细胞培养液、抗原A、抗原B、阳性质控加入反应孔，孵育16～20h。
②去细胞培养液，用PBS缓冲液重复洗涤至少3遍，加入标记抗体，孵育1h。
③去上清，洗涤，加入底物显色溶液，室温孵育7min。
④洗涤培养板，待反应板干燥后，读取斑点数。
（4）结果判定
有反应性：
①对照孔斑点数为0～5h，反应孔斑点数-空白对照孔斑点数≥6。
②对照孔斑点数为6～10h，反应孔斑点数≥2X空白对照孔斑点数。
无反应性：不符合上述“有反应性”的标准，并且对照孔正常则为“无反应性”。
（5）注意事项
①注意无菌操作避免试剂、检测孔、细胞悬液和细胞培养液的污染。
②不同的分离和洗涤技术、培养时间和温度将会影响实际的操作结果，应当避免。
③在使用化学试剂时应当注意所有的化学试剂都有潜在的危害。
④不同试剂盒批号的试剂不能混用。
⑤当操作人源性样本时应当注意，所有血液样本都有潜在的传染性。
（6）临床意义
该方法作为诊断活动性结核病较准确的一种方法，具有灵敏、特异、快速等特点。本试验所得结果与结核菌素试验相当，且具有受BCG接种影响小，又能与非结核分枝杆菌进行区分的优点，同时还可避免结核菌素试验在操作上与结果判断上存在的主观因素的影响。
（三）细菌学检查
1.抗酸杆菌涂片
（1）方法原理
分枝杆菌的染色镜检可以使用不同的染料，但均是依据分枝杆菌细胞膜含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，菌酸具有抗酸性，染料将分枝杆菌染色后，分枝杆菌细胞膜能抵抗盐酸乙醇等脱色剂作用，使分枝杆菌能保持染料的颜色。分枝杆菌抗酸性是菌体内的分枝菌酸、RNA蛋白及其细菌壁的完整性相结合的综合反应，即抗酸性的强弱除与细菌壁的完整性有关以外，还与其细菌成熟和衰老程度有关。
萋-尼氏染色法，是复红染色液在石炭酸的协同作用下，并对标本加热促进染色剂同被染细胞的结合，将抗酸杆菌染成紫红色，随后使用酸性酒精脱色，抗酸杆菌能保持紫红色，而其他脱落细胞或标本中的非抗酸杆菌被酸性酒精脱去颜色，后经复染剂亚甲兰复染为蓝色，光学镜下观察，可在蓝色背景下看到紫红色的杆状抗酸菌。
（2）主要仪器及试剂
①仪器：生物安全柜、离心机、高压灭菌器、显微镜、涡旋振荡器。
②试剂：石炭酸复红液（Ⅰ液）、5%盐酸酒精液（Ⅱ液）、美兰染色液（Ⅲ液）。
（3）操作流程
①涂片固定后加Ⅰ液5至10min。
②弃去Ⅰ液后加Ⅱ液脱色至无红色为止，水洗。
③滴加Ⅲ液复染30s，水洗，待干，油镜镜检。
（4）结果判定
紫红色为结核分枝杆菌。
x1000镜下所见AFB数量为0，则报告未见抗酸杆菌；
1～8条/300视野：报告抗酸杆菌菌数；
3～9条/100视野，报告1+；
1～9条/10视野，报告2+；
1～9条/每视野，报告3+；
≥10条/每视野，报告4+。
（5）注意事项
①染色时间不宜过长。
②使用完试剂后，务必盖好盖子，以防止试剂挥发。
③由于石炭酸对人体皮肤有较强的腐蚀性和刺激性，配戴好一次性手套后再进行实验操作。
（6）临床意义
结核抗酸染色法是临床上用于确诊病人是否有结核菌感染的一种检测方法，具有简单、快速、易行、可靠、省时、方便的优点，但是敏感性比较低。
2.结核杆菌分离培养（固体培养法）
（1）方法原理
罗氏培养基含有鸡蛋、硫酸镁、磷酸二氢钾和丙三醇等结核杆菌生长所需的营养物，同时培养基中的孔雀绿可以抑制杂菌生长。
（2）主要仪器及试剂
二级生物安全柜、恒温培养箱、涡旋振荡器、改良罗氏培养基。
（3）操作流程
①拧开酸性改良罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的冷凝水，如果冷凝水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将冷凝水弃去。
②以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，吸取接近结束时，将吸管口移出液面，使吸管前端一段不含液体，避免液体意外滴落。
③保持培养基斜面水平或底端略低，均匀接种至酸性改良罗氏培养基斜面上，每支培养基使用接种2滴（0.1～0.15mL），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部。
④将用过的吸管置于生物安全柜内的废液缸内。
⑤旋上培养管螺旋盖，不要太紧。
⑥轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀地在斜面上铺开。
⑦将培养基放置在斜面培养架上，保持培养基斜面水平向上。
（4）结果判定
无菌落生长，报告培养阴性；
菌落生长不及斜面面积1/4，报告实际菌落数；
菌落占斜面面积1/4，报告1+；
菌落占斜面面积1/2，报告2+；
菌落占斜面面积3/4，报告3+；
菌落布满培养基斜面，报告4+。
（5）注意事项
①染色时间不宜过长。
②由于石炭酸对人体皮肤有较强的腐蚀性和刺激性，进行相关操作时要做好防护。
③培养基开启后必须尽快使用，不能长期存放。
④接种前，需检查培养基，如发现培养基污染或者超出有效期，则不能使用。
⑤使用后的培养基必须统一进行灭菌处理。
（6）临床意义
①为结核病的诊断提供可靠依据。
②活菌可用于菌种鉴定，为结核与非结核分枝杆菌病鉴别诊断提供依据。
③活菌可用于药物敏感性测定，指导临床药物治疗。
④活菌可用于细菌毒力测定。
⑤用于流行病学调查，明确传染源，确定预防措施。
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