新冠检测成果：全球确诊1.24亿人次，新增273万死亡

（一）核酸检测

2019年12月以来，湖北省武汉市部分医院陆续发现了多例有华南海鲜市场暴露史的不明原因肺炎病例，现已证实是由一种新型β冠状病毒引起的急性呼吸道传染病。2020年2月11日，国际病毒分类委员会将该新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。同日，世卫组织将这一病毒所致疾病名称命名为COVID-19。目前，新型冠状病毒肺炎已在全球200多个国家和地区流行，全球新冠累计确诊病例约1.24亿人次，累计死亡病例273万人次。新冠肺炎疫情是百年来全球发生的最严重的传染病大流行，也是近20年来继SARS和中东呼吸综合征（MERS）后出现的第三种跨物种感染人类的人畜共患病的冠状病毒。同时,此次疫情是传播速度最快、感染范围最广、防控难度最大的重大突发公共卫生事件。

2020年1月20日，国家卫健委发布1号公告，将新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施，并将新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。国家卫健委要求各级省、自治区、直辖市人民政府成立地方突发事件应急处理指挥部，随后各省市陆续启动突发公共卫生事件一级响应，全国动员、全面部署、全民参与。虽然我国对COVID-19疫情的防控取得了阶段性胜利，但2020年4月和5月，我国黑龙江和哈尔滨及吉林省出现散发疫情，6月北京新发地市场局部疫情暴发，国家卫健委每日通报的新冠确诊新增病例仍在增加，疫情防控的形势仍不容乐观。当前我国疫情防控的重点，已从对本土病例的防控转变为对境外输入性病例的防控，以及对经冷链运输进口物品携带污染及密切接触人群的监测。核酸检测阳性是发现SARS-CoV-2携带者（SARS-CoV-2核酸阳性但无明显临床和影像学表现，且血清特异性SARS-CoV-2抗体阴性者）和确诊SARS-CoV-2感染的金标准。

SARS-CoV-2属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属。冠状病毒科分为α、β、γ和δ四个属，可感染哺乳类动物如人、鼠、猪、猫、犬、蝙蝠、牛和禽类脊椎动物，引起宿主呼吸道、肠道、肝和神经系统疾病，其中，又以β-CoVs对人类危害最严重。SARSCoV-2是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoVOC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-COV。其中HCoV-229E、HCoV-NL63为α-冠状病毒属成员，其他5个是β-冠状病毒属成员。HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1通常引起普通感冒、腹泻等较轻微的自限性疾病，而SARS-CoV、MERS-COV和SARS-CoV-2则具有高致病性，可以导致严重的下呼吸道感染，更有可能进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和出现肺外症状。

图3-45　冠状病毒结构图

SARS-CoV-2形态结构与已知的冠状病毒基本一致。冠状病毒粒子形态不规则，略呈球形，直径约60～220nm，有包膜，包膜表面覆盖着长12～24nm的囊状胶原纤维突起（纤突），这是冠状病毒最突出的特征。冠状病毒粒子具有5个必需基因，分别针对核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。刺突蛋白通过结合血管紧张素转化酶2（ACE-2）进入细胞。体外分离培养时，新型冠状病毒96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在VeroE6和Huh-7细胞系中分离培养约需4～6天。S蛋白包含两个功能性亚基（S1和S2），是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点，介导病毒与宿主细胞的受体结合及膜融合。E蛋白较小，在病毒体内含量较少，E蛋白是高度分化的，但有共同的结构，主要参与病毒的组装和释放，并具有离子通道活性。研究表明，在SARS-CoV中，E蛋白中的离子通道活性不是病毒复制所必需的，而是保证其毒力的一个决定因子。M蛋白在病毒颗粒中以二聚体的形式存在，是病毒颗粒中最丰富的糖蛋白，被认为在形成病毒包膜和保持其结构方面有重要作用。N蛋白是存在于核衣壳中的唯一蛋白质。它由两个独立的结构域组成，即N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD），这两个结构域都能在体外结合RNA，但是每个结构域结合RNA的机制不同。

SARS-CoV-2基因组全长在26～32kb之间，为单股正链RNA病毒，是基因组较大的RNA。上海市公共卫生临床中心在美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank序列数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中上传了第一个SARS-CoV-2基因组数据（GenBankMN908947），测序结果显示，SARS-CoV-2含有29903个核苷酸，编码9860个氨基酸。基因组5′端有甲基化帽，3′端有PolyA尾，6个开放阅读框（ORFs）。5′端ORF1a和ORF1b编码有1～16个非结构蛋白（nsp1～16），共同参与病毒的复制和转录。3′端编码4种结构蛋白：刺突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）和8种辅助蛋白，在病毒颗粒的组装中发挥重要作用。

图3-46　冠状病毒蛋白结构片段图

病毒是由核酸与蛋白构成的非细胞形态，自身无法通过细胞分裂的方式实现复制与繁殖，需要寄生在活的宿主细胞内，依赖宿主细胞的原料、能量供给与场所，才能实现自我复制与病毒释放。病毒的生命周期可概括为三个过程：感染宿主细胞、完成自我复制、释放到宿主细胞外。

SARS-CoV和MERS-CoV类似，SARS-CoV-2的生物学特性主要表现为对紫外线和温度敏感，56℃加热30min即能灭活病毒，紫外线照射60min能杀死病毒。病毒的包膜含脂质成分，对有机溶剂敏感，75%的酒精、乙醚、氯甲醛、含氯消毒剂、过氧乙酸等能够有效地将其灭活。研究显示，冠状病毒可以在不同物体的表面存活2h至9d。随温度升高至30℃及以上，冠状病毒的存活时间变短，而在室温条件下，病毒在50%湿度比在30%湿度环境中存活时间长。SARS-CoV-2在气溶胶中可持续存活3h。

1.临床诊断（流行病学资料）

（1）传染源

图3-47　冠状病毒传染源路径图

目前积累的有效证据还不足以揭示新冠病毒的真正源头和中间宿主。最新研究表明，新冠病毒SARS-CoV-2和来自马来菊头蝠、中菊头蝠及穿山甲的冠状病毒亲缘关系最近，提示SARS-CoV-2可能来源于菊头蝠属的蝙蝠携带的冠状病毒，蝙蝠很可能是SARS-CoV-2的自然界宿主。早期推测，SARS-CoV-2的中间动物宿主可能是动物交易市场出售和杀死的野生动物物种，因为许多最初的COVID-19病例与之相关，这表明可能是动物作为直接宿主传播人类的事件。最近一些基于宏基因组测序的研究表明，从穿山甲标本中发现的新的冠状病毒基因组与SARS-CoV-2具有85%～92%的核苷酸序列同源性，提示穿山甲作为SARS-CoV-2的中间动物宿主之一的可能性。但SARS-CoV-2在蝙蝠、穿山甲或其他可能的动物（如蛇、雪貂、犬科和猫科动物）中的进化途径仍待建立和验证。

《新型冠状病毒肺炎防控指南（第八版）》指出，基于目前的流行病学调查和研究结果，新冠肺炎潜伏期为1～14d，多为3～7d；发病前1～2d和发病初期的传染性相对较强；传染源主要是新冠肺炎确诊病例和无症状感染者。

（2）传播途径

①呼吸道飞沫传播

患者打喷嚏、咳嗽、说话的飞沫，多为直径大于5μm的含水颗粒物，可在空气中飞行6英尺或更短的距离。与新冠肺炎感染者近距离接触（6英尺以内）感染风险最大。在某些情况下，新冠肺炎感染者可能感染距离其6英尺以外的人，比如当新冠肺炎感染者唱歌或运动时，会呼吸急促，专家认为在这种条件下，新冠肺炎感染者产生的大量的较小的传染性飞沫和颗粒物会聚集在一起，由于此时病毒量增加极易传播给距离其6英尺以外的人，与新冠肺炎感染者共处一室或者在感染者离开后短时间内进入该场所，均可能被感染。当然，这种传播通常发生在通风不良的密闭空间内。

图3-48　冠状病毒传染距离图

②接触传播

指飞沫沉积在物品表面，接触污染手后，再接触口腔、鼻腔、眼睛等黏膜，导致感染。SARS-CoV-2在光滑的物体表面可存活数小时，如果温湿度合适，它可以存活数天。

③气溶胶传播

飞沫混合在空气中，形成气溶胶，吸入后导致感染。在相对密闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下，存在气溶胶传播的可能。对SARS-CoV-2在气溶胶中稳定性研究显示病毒可以存活长达3h。

（3）易感人群

人群普遍易感，不同年龄阶段的人均可感染SARS-CoV-2。9岁及以下儿童感染SARSCoV-2病例较少，以家庭聚集性为主要传播特征。以下特定人群更应引起重视：

①免疫力低下者

如糖尿病、贫血、肿瘤、白血病、艾滋病患者、长期服用激素、免疫抑制剂者，孕妇及营养不良等人群。

②老人

免疫力相对低下，易感染，尤其合并慢性基础疾病的老年人。其中老年人和具有基础疾病人群患有COVID-19严重疾病和死亡的风险极高。

③密切接触者

患者的密切接触者和医务人员。

（4）临床表现

新型冠状病毒肺炎以急性呼吸道感染为主要表现，包括发热、干咳、乏力。部分患者以嗅觉、味觉减退或丧失等为首发症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、结膜炎、肌痛和腹泻等症状。

①轻型患者

可表现为低热、轻微乏力、嗅觉及味觉障碍等，无肺炎表现。同时，也有少数患者在感染新型冠状病毒后，无明显临床症状。

②重症患者

在发病一周后，多数可出现呼吸困难或低氧血症，严重者甚至可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、休克等，并危及生命。极少数患者还可出现中枢神经系统受累及肢端缺血性坏死等情况。值得注意的是，重型、危重型患者病程中，可仅表现为中低热，或无明显发热。

2.标本采集对象

引起COVID-19的病原体SARS-CoV-2由遗传物质RNA和保护遗传物质的蛋白质衣壳组成，能够通过刺突蛋白识别并结合宿主细胞表面血管紧张素转换酶Ⅱ（ACE2）受体，浸入并感染宿主细胞，并且进行复制与增殖。选择患者或疑似病例ACE2受体表达水平较高的部位采集含有细胞的标本。国务院应对新型冠状病毒肺炎联防联控机制综合组发布的新冠肺炎防控方案（第八版）中《新冠病毒样本采集和检测技术指南》指出，新冠病毒检测标本采集对象为新冠肺炎病例、可疑感染人员和其他需要进行检测的人员，以及可能被污染的环境或物品等。

表3-2　标本采集对象

（1）标本采集要求

①在标本采集过程中，采样人员应着个人防护装备（PPE）。要求：N95及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套；如果接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物，应及时更换外层乳胶手套。操作人员应当掌握正确的洗手时机和洗手方法（七步洗手法），不随意触摸面部皮肤及眼、鼻腔等黏膜相关部位。

图3-49　七步洗手法步骤图

②住院病例的标本由所在医院的医护人员采集，密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。采集标本时，要根据不同采集对象设置不同的采样区域，发热患者前往发热门诊就诊、采样，未设置发热门诊的机构应设置发热患者专用采样区域，将发热患者与其他检测人群分区采样，避免交叉感染。

③无症状感染者、入境人员、密切接触者在隔离观察期间应采集鼻咽拭子进行核酸检测，解除隔离时应同时采集2份鼻咽拭子样本，分别使用不同核酸检测试剂检测，2次检测原则上由不同检测机构开展。

④根据临床及实验室检测工作的需要，可在住院、隔离期间多次采样，可同时采集呼吸道、血液、便等多种标本。采样人员应严格遵循采样规范采集标本，保障所采集标本质量符合要求，同时应详细记录受检者信息，可利用条形码扫描等信息化手段采集相关信息。

⑤人群筛查应根据核酸提取、检测所用试剂的要求确定采样管，可选择含病毒灭活剂（胍盐或表面活性剂等）的采样管。用于病毒分离的标本应放置于不含有病毒灭活剂的采样管。

⑥物品和环境监测应根据监测目的和防控需求，确定采样物品、位置与数量，采样时应严格遵循采样规范。

（2）样本采集种类

样本采集包括上呼吸道标本采集和下呼吸道标本采集。上呼吸道标本的采集：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等；下呼吸道标本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液等。

每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本或下呼吸道标本），重症病例优先采集下呼吸道标本；出现腹泻症状的病例，需留取便标本，根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。对集中隔离人员，要通过鼻咽拭子采集上呼吸道标本；对其他人员，要首选鼻咽拭子。不同类型标本检测核酸阳性率和含有的病毒载量不同。呼吸道样本中阳性检出率顺序：肺组织（金标准）→支气管或肺泡灌洗液→深咳痰或抽吸痰→鼻咽拭子→口咽拭子。

①鼻咽拭子的采集

A.口咽拭子的采集（无法采集鼻咽拭子时可选用）被采集人员先用生理盐水漱口。采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润（禁止将拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起过敏）。采集时，被采集人员头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，拭子放入生理盐水中湿润，将拭子越过舌根，在两侧扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后在咽后壁擦拭至少3次，应避免触及舌、口腔黏膜和唾液。采样完毕，将拭子投入含2～3mL病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的收集管中，折断拭杆，旋紧管盖。

B.鼻咽拭子的采集

采样人员一手轻扶被采集人员的头部，一手执拭子贴鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道呈弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周（如遇反射性咳嗽，应停留片刻），取另一根拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔，上述两根拭子浸入同一含3mL病毒保存液的采样液管中，尾部弃去，旋紧管盖。将采集管置于稳定的置物盘上。每例采集后采集人员均应进行手消毒。

C.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物

用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取黏液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的黏液，并用3mL采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50mL注射器上来替代收集器）。

②深咳痰液的采集

要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3mL采样液的采样管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检测前，加入2～3mL采样液，或加入痰液等体积的痰液消化液。

表3-3　痰液消化液储存液配方

使用时将储存液用去离子水稀释至50mL，与痰液等体积混合使用，或者参照试剂说明进行使用，也可采用痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

③支气管灌洗液的采集

将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5mL生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的黏液，并用采样液冲洗收集器1次（亦可用小儿导尿管接在50mL注射器上来替代收集）。

④肺泡灌洗液

局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50mL，总量100～250mL，不应超过300mL。

⑤粪便标本的采集

留取粪便标本约10克（花生大小）。取1mL标本处理液，挑取黄豆粒大小的便标本加至管中，轻轻吹吸3～5次，室温静置10分钟，以8000rpm离心5分钟，吸取上清液进行检测。粪便标本处理液可自行配制，配方表如下。

表3-4　粪便标本处理液配方

也可使用HANK’S液或其他等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液溶解便标本制备便悬液。如患者出现腹泻症状，则留取粪便标本3～5mL，轻轻吹打混匀后，以8000rpm离心5min，吸取上清液备用。

⑥肛拭子

用消毒棉拭子轻轻插入肛门3～5cm，再轻轻旋转拔出，立即放入含有3～5mL病毒保存液的15mL外螺旋盖采样管中，弃去尾部，旋紧管盖。

⑦血液标本

尽量采集发病后7d内或危重症的急性期抗凝血，采集量3～5mL，室温静置30min，1500～2000rpm离心10min，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。建议使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的真空采血管采集血液。

⑧尿标本

留取中段晨尿，采集量2～3mL。

⑨物体表面标本

包括进口冷链食品或进口货物的内外包装表面，以及运输储藏工具等可能被污染的部位进行涂抹采集的标本。参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021）推荐的方法，采样拭子充分浸润病毒保存液后在表面重复涂抹，将拭子放回采样管浸润，取出后再次涂抹采样，重复3次以上。对表面较大的物体进行多点分布式采样。

⑩污水标本

根据海运口岸大型进口冷冻物品加工处理场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处、污水流向的下游或与市政管网的连接处等2～3处点位进行采样。参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021）推荐的方法，采集污水的拭子样本时，用拭子浸入吸附污水，将拭子放回采样管浸润，取出后再次浸入污水，重复3次以上，对每个污水采样位置应进行多点分布式采样。采集污水的水体样本时，用聚乙烯塑料瓶收集1～1.5L污水，大于1.5L体积的污水采集，可以使用聚乙烯塑料桶或现场水样专用富集设备。污水水体样本采集前，先充分混合均匀后取样；如果污水难以充分混合，出现分层现象时，可按各层水量的比例分层取样。

3.标本包装

标本采集后需在生物安全为二级的实验室生物安全柜内分装。

图3-50　标本包装—生物安全运输箱图

样本包装的要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的标准，涉及外部标本运输的，应根据标本类型，按照A类或B类感染性物质进行三层包装。采用三层包装系统，由内至外分别为主容器、辅助容器和外包装。主容器即标本采集管，注明标本编号、患者姓名、采集时间等信息，使用大小合适的塑料袋密封，直立放置于有衬垫材料的辅助容器内。外包装即标本转运箱，必须是刚性的，在所有运输条件下均不发生变形。外表面应贴有高致病性病原微生物危险标签、运输登记表和放置方向标识。

4.样本保存

用于病毒分离和核酸检测的标本应尽可能在2～4h运送至临床实验室进行预处理和检测。能在24h内检测的标本可置于4℃保存；24h内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。血清可在4℃存放3d，-20℃以下可长期保存。应设立专库或专柜单独保存标本。

新型冠状病毒毒株及其样本应由专人管理，准确记录毒株和样本的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株和样本的安全，严防发生无用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。

5.标本转运

标本采集后应尽快送往实验室，标本运送期间应避免反复冻融。如果需要长途运输标本，建议采用干冰等制冷方式进行保藏。COVID-19确诊或疑似患者标本都应在2～8℃下转运，且转运时间不宜超过24h；如预计超过24h，应在-70℃或更低温度条件下保存和转运。进行标本包装时，制冷剂应放置于辅助容器和外包装之间。标本运输人员应接受生物安全操作规范培训，应配有工作服、防护帽、外科口罩、手套。运输人员应携带酒精或含氯消毒液，以便在发生意外或紧急情况时及时处理。(www.xing528.com)

新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求；环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373，包装符合国际民航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求。通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。

6.标本检测

（1）检测人员要求

实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。

（2）核酸检测实验室布局

新冠病毒核酸检测实验室按功能区布置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开展新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区。根据所采用仪器的实际情况，标本制备区、扩增区和产物分析区可进行合并。集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立，单向流动（注意风向，压力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原则。

各区的功能如下：

①试剂储存和准备区

用于分装、储存试剂、制备扩增反应混合液，以及储存和准备实验耗材。该区应配备冰箱或冰柜、离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为防止污染，该区宜保持正压状态。

②标本制备区

标本转运桶的开启、标本灭活（必要时）、核酸提取及模板加入至扩增反应管等。该区应配备冰箱或冰柜、生物安全柜、离心机、试验台、微量加样器，可根据实际工作需要选配自动化核酸提取仪等。标本转运桶的开启、分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压状态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立的生物安全二级（BSL-2）实验室进行，提取的核酸可以转运至该区加至扩增反应液中。

③核酸扩增和产物分析区

进行核酸扩增反应和产物分析。该区应配备实时荧光定量PCR仪。为防止扩增产物污染环境，该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。

（3）检测原理

①实时荧光RT-PCR

实时荧光RT-PCR是检测SARS-CoV-2核酸使用最为普遍的方法，也是目前临床上病原体检测使用最为普遍的方法。实时荧光RT-PCR原理是反应体系中的荧光探针（或其他荧光标志物）与PCR产物相结合，通过分析每个循环结束后的荧光强度，实时监测反应体系中PCR产物的量。荧光标记根据使用的类型可分为特异性荧光标记和非特异性荧光标记两大类。前者包括TaqMan探针、双杂交探针、分子信标和蝎形探针等，而非特异性荧光标记主要为双链DNA交联荧光染料。SARS-CoV2核酸检测以TaqMan探针的使用最为普遍。

图3-51　实时荧光RT-PCR检测原理图

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，设计为可与目标序列上游引物和下游引物之间的互补配对。荧光基团标记在探针的5＇端，如6-羧基荧光素（6-FAM）、六氯-6-羧基荧光素（HEX）；而探针的3＇端标记淬灭基团，如6-羧基-四甲基罗丹明（TAMRA）。根据荧光共振能量转移（FRET）原理，即一个荧光基团与另一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发射光谱）距离邻近至一定范围时，淬灭基团会吸收荧光基团在激光作用下产生的荧光，如果荧光基团和淬灭基团分开，淬灭作用即消失，荧光基团发出荧光。因此，当完整的探针与目标序列退火配对时，荧光基团发射的荧光因与3＇端的淬灭基团很近，其发出的荧光被淬灭。但发生PCR扩增时，引物在Taq酶作用下进行延伸时，由于Taq酶除了具有DNA聚合酶的活性以外，还具有5＇—3＇核酸外切酶的活性。因此，当延伸到达TaqMan探针时，Taq酶将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离而发射荧光。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光信号的强度与扩增产物的数量呈正相关。

指南中的核酸检测方法主要针对新冠病毒基因组中开放读码框1ab（ORF1ab）和核壳蛋白（N）。

靶标一（ORF1ab）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

荧光探针（P）：5＇-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3＇

靶标二（N）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

荧光探针（P）：5＇-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3＇

荧光PCR法检测下限为102-103copies/mL，部分产品可达10copies/mL。该方法检测耗时存在差异，通常两步法（即核酸提取与PCR扩增步骤独立进行）需3～3.5h（包括核酸提取0.5～1.5h，PCR扩增1.5～2h），一步法（即核酸提取与PCR扩增一体化）可缩短至1h以内。

②恒温扩增法

恒温扩增法是在固定的温度条件下进行扩增，包含恒温扩增实时荧光法和恒温扩增芯片法。恒温扩增实时荧光法是将恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合，可将SARS-CoV-2核酸检测全流程时间缩短至1.5h以内。恒温扩增芯片法是将恒温扩增技术与微流控芯片技术相结合，其特点是可在同一份样本中同时检测多种病原体。恒温扩增法具有集成能力强、自动化程度高、检测时间短、检测下限低（可达102copies/mL）等特点。

③其他PCR方法

如杂交捕获免疫荧光法、RNA捕获探针法、双扩增法和巢式多重PCR法等在SARS-CoV-2核酸检测中亦发挥了重要作用。SARS-CoV-2核酸检测的方法较多且各具特点，即使同一种检测方法，由于检测试剂生产厂家或检测仪器不同，所需检测时间及检测下限均可能存在差异。因此，在实际工作中实验室应根据所使用的检测试剂及设备说明书，制定相应的标准操作规程，开展SARS-CoV-2核酸检测工作。

（4）试剂和仪器

目前国内获国家药品监督管理局批准的新型冠状病毒检测试剂以实时荧光RT-PCR为主，已近20种，制造商有上海伯杰医疗科技股份有限公司、华大生物科技（武汉）有限公司、中山大学达安基因股份有限公司、圣湘生物科技股份有限公司、上海捷诺生物科技有限公司，上海复星长征医学科学有限公司、上海之江生物科技股份有限公司等。

医学实验室使用的SARS-CoV-2核酸检测试剂（实时荧光PCR法）经过标本前处理、核酸提取和纯化，然后在实时荧光PCR仪上完成扩增和产物分析。在有大规模人群检测需求时，核酸提取和纯化及反应体系的配制均可以通过自动化仪器来完成，检测通量的限制主要来自实时荧光RT-PCR（通常为96个反应）。当有大规模标本检测需求时，可以通过自动化仪器完成核酸提取及反应体系配制，然后人工将反应体系转移到产物扩增区进行检测。此外，为进一步提高检测速度和操作的简便性，自动液体工作站也用于医学实验室的大规模SARSCOV-2标本检测。自动液体工作站是整合了标本裂解、核酸提取、核酸扩增和检测功能的全自动操作平台，在实现高通量标本处理、快速获得检测结果的同时，通过高精度的准确移液，避免人工操作导致误差，提高标本处理的一致性和结果的可重复性。自COVID-19疫情暴发以来，多家试剂制造商研发了可用于检测SARS-CoV-2核酸的自动液体工作站。

（5）荧光定量RT-PCR检测流程

实验室应当制定标准操作程序（SOP），并严格按照SOP进行操作。接到标本后，应当在生物安全柜内对标本进行清点核对，并依据SOP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检的流程。

①试剂准备

应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂，建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取，建议根据核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管，不建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。

②标本处理

使用含胍盐等灭活型采样液的标本无须进行灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液的标本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核酸提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病毒。不推荐采用56℃孵育30min的处理方式灭活病毒，该条件不能保障充分灭活病毒。污水样本处理可参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021）推荐的方法。

③核酸提取

将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打开标本采集管加样，或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成后立即封盖。取适量核酸加至PCR扩增反应体系中。

④核酸扩增

将扩增体系放入荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按一般医疗废物转移出实验室处理。

（6）结果判断

阴性：无Ct值、无S形扩增曲线。

阳性：Ct值小于等于检出限，且有S形扩增曲线，可报告为阳性。

灰区：Ct值位于灰区，建议重复实验，若重做Ct值仍处于灰区，但出现明显的S形扩增曲线，该样本判断为阳性，否则为阴性。

注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。

实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：

条件一：同一份标本中新冠病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。

条件二：两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本2次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。

流行病学结合临床分析原则虽然核酸检测是SARS-CoV-2病原学诊断的金标准，但仍存在一定的局限性。当临床高度怀疑SARS-CoV-2感染而核酸检测阴性时，需结合患者肺部CT、SARS-CoV-2特异性抗体、血常规等其他检测结果进行综合判断。环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留污染的影响。

核酸检测结果假阴性的可能原因包括：样本质量差；样本采集时间过早或过晚；样本保存、运输和处理不当；其他原因如病毒变异、PCR抑制等。假阳性结果多由实验室污染或操作不当造成。

（7）复 检

以下情况建议复检：

①样本经PCR扩增后，目的基因Ct值大于试剂说明书阈值，但原始峰图有信号；

②扩增结果为阳性，但原始峰图并非典型的“S”形曲线；

③双靶标试剂检测结果不一致；

④双份试剂检测结果不一致；

⑤检测结果与临床症状、影像学表现不一致；

⑥若不同病程阶段核酸检测结果发生变化，需连续多次采样；

⑦大规模人群筛查流行率极低（＜0.1%）时，出现阳性结果，应使用1～2种更灵敏且扩增区域不同的试剂复检。

（8）质量控制

①性能验证

临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限≤500Cop:es/mL）。

②室内质控

实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国卫办医函〔2020〕53号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5～3倍）、3份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。大规模人群筛查时，一旦出现阳性结果，应对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。

物品和环境样本的采集检测，还需在采样前及采样过程中至少设一个现场空白样本及一个运输空白样本，以进行过程中的质量控制。

③室间质评

实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构组织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，可适当增加室间质评频率。不按要求参加室间质评的，或室间质评结果不合格的，应通报批评并上报国家卫健委，待室间质评通过后方可开展核酸检测。

7.实验室废弃物处理及实验室污染的处理

按照国家卫生健康委印发的《关于做好新型冠状病毒感染的肺炎疫情期间医疗机构医疗废物管理工作的通知》处理。

医疗废物专用包装袋、利器盒的外表面应当有警示标识，在盛装医疗废物前，应当进行认真检查，确保其无破损、无渗漏。医疗废物收集桶应为脚踏式并带盖。医疗废物达到包装袋或者利器盒的3/4时，应当有效封口，确保封口严密。应当使用双层包装袋盛装医疗废物，采用鹅颈结式封口，分层封扎。

盛装医疗废物的包装袋和利器盒的外表面被感染性废物污染时，应当增加一层包装袋。分类收集使用后的一次性隔离衣、防护服等物品时，严禁挤压。每个包装袋、利器盒应当系有或粘贴中文标签，标签内容包括：医疗废物产生单位、产生部门、产生日期、类别，并在特别说明中标注“新型冠状病毒感染的肺炎”或者简写为“新冠”。

医疗废物中含病原体的标本和相关保存液等高危险废物，应当在产生地点进行压力蒸汽灭菌或者化学消毒处理，然后按照感染性废物收集处理。

在运送医疗废物前，应当检查包装袋或者利器盒的标识、标签以及封口是否符合要求。工作人员在运送医疗废物时，应当防止造成医疗废物专用包装袋和利器盒的破损，防止医疗废物直接接触身体，避免医疗废物泄漏和扩散。每天运送结束后，对运送工具进行清洁和消毒，含氯消毒液浓度为1000mg/L；运送工具被感染性医疗废物污染时，应当及时消毒处理。

医疗废物暂存处应当有严密的封闭措施，设有工作人员进行管理，防止非工作人员接触医疗废物。医疗废物宜在暂存处单独设置区域存放，尽快交由医疗废物处置单位进行处置。用1000mg/L的含氯消毒液对医疗废物暂存处地面进行消毒，每天两次。医疗废物产生部门、运送人员、暂存处工作人员以及医疗废物处置单位转运人员之间，要逐层登记交接，并说明其来源于新型冠状病毒感染的肺炎患者或疑似患者。

严格执行危险废物转移联单管理，对医疗废物进行登记。登记内容包括医疗废物的来源、种类、重量或者数量、交接时间、最终去向以及经办人签名，特别注明“新型冠状病毒感染的肺炎”或“新冠”，登记资料保存3年。

（二）免疫学检测

血清抗体检测仅用作对新冠病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测，不能单独作为诊断指标用于筛查。联合使用血清抗体检测与核酸检测，有助于提高疾病的检出率，尽可能地找出确诊患者，更有利于疫情的控制。新型冠状病毒特异性IgM抗体、IgG抗体阳性，发病1周内阳性率均较低。由于试剂本身阳性判断值原因，或者体内存在干扰物质（类风湿因子、嗜异性抗体、补体、溶菌酶等），或者标本原因（标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全等），抗体检测可能会出现假阳性。一般不单独以血清学检测作为诊断依据，需结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况进行综合判断。

对以下患者可通过抗体检测进行诊断：①临床怀疑新冠肺炎且核酸检测阴性的患者；②病情处于恢复期且核酸检测阴性的患者。

IgM和IgG是病毒感染后在人体内先后出现的特异性抗体。IgM是免疫系统受病原体刺激后最先产生的抗体，起到“先锋免疫”的作用；IgG在血液和组织中含量丰富，是抗病毒免疫的绝对主力。新型冠状病毒肺炎发病7d后，血清特异性抗体逐渐产生，首先出现的是免疫球蛋白IgM抗体，然后出现IgG抗体。因此，IgM抗体增高提示近期急性感染，IgG抗体增高提示既往感染。如果疑似病例血清特异性IgM和IgG抗体阳性，IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4倍及以上升高，则可以诊断其感染了新冠病毒。基于IgM和IgG双抗体的检测方法具有灵敏度高、诊断及时、适用范围灵活广泛等优点。免疫方法学上有需要仪器设备的化学发光免疫法、酶联免疫法、荧光定量层析法、上转发光层析法、免疫比浊法等，还有无须匹配检测设备的胶体金层析法。如何快速、准确筛查并确诊新冠肺炎患者成为当前全球战“疫”的重中之重。免疫诊断方面最为常用的是胶体金检测法。

1.检测人员要求

实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。

2.胶体金检测试剂检验原理

主要有两种：一种是夹心法，又分为采用双抗原夹心法检测新冠病毒总抗体，与采用双抗体夹心法检测新冠病毒特异性抗原；另一种是采用间接法或捕获免疫方法检测新冠病毒IgM、IgA、IgG抗体。由于新冠病毒感染属于下呼吸道感染疾病，因此采用鼻咽拭子为样本的双抗体夹心法在样本选择上可能存在较高漏检风险，而采用血液为样本的检测方法可靠性相比较要更高。IgG是体液免疫应答产生的主要免疫球蛋白抗体，其在体内含量高、分布广，一般出现感染的现症阶段或者恢复阶段。在急性感染的一般过程中，当IgG抗体出现后，浓度会持续增高，IgA抗体与之同步升高，IgM则持续降低，直至消失，IgG抗体会较长时间存在。总体上说，IgM、IgA、IgG三种抗体分型的检测可有效用于疾病病程发展的评估。针对感染早期病例，单独检测IgM抗体不如IgM+IgA检测阳性检出率好。对于感染中后期，IgG抗体可有效提升阳性检出率。因此多抗体联合检测结果更加可靠。

3.诊断价值

图3-52　IgA、IgM、IgG抗体疾病病程发展水平展现图

IgA、IgM、IgG抗体联合快速检测可用于疾病病程发展的评估。T1指IgA和（或）IgM的检测结果，阳性结果提示可能为新近发生感染，可用于辅助诊断COVID-19的早期及现症感染；T2是IgG检测的结果，单独IgG阳性结果提示可能发生感染有一段时间，可用于辅助诊断COVID-19的中后期或既往感染。新冠病毒IgA、IgM抗体检测可以很好地补充核酸阴性新冠感染患者的诊断，同时对无症状感染患者的诊断也具有价值。聚焦早期诊断，尽可能缩小窗口期，对疑似病例的早诊断具有重要研究价值。抗体检测也是确诊是否感染新冠病毒的一种方法，对疑难病症进行核酸和抗体两项检测，可提高检测的准确性，避免漏诊；抗体检测操作简单、快速，安全性较高，可降低医务人员被感染的风险。

4.质量控制

建议每批检测设立1个阳性质控、1个阴性质控。阳性质控检测为阳性，阴性质控检测为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测标本。对所用仪器进行验证和校准，对仪器（如涉及2台或以上）、人员（所有检测人员）、方法（如涉及2种不同试剂/方法）和试剂（不同批号间）进行实验比对。建议弱阳性标本应至少用2个厂家的试剂复核，尽可能使用包被抗原基本一致的试剂盒。若包被抗原不一致，检测结果可能有所不同，如包被S、N或S+N的不同，检测结果有可能就不一致。

试剂使用前，应做性能验证，确认该试剂与使用的检测仪器是否作为一个检测系统，确认阴阳质控是否在控、内参曲线是否正常、性能是否良好、性能指标是否能达到试剂盒说明书的声明和行业标准要求。性能验证参数至少包括精密度、符合率和检出限，同时还需要在临床检测过程中累积室内质控和临床标本检测得到的数据，以及与其他实验室间的结果进行对比，开展进一步的评价和其他性能指标的验证（如精密度、符合率等）。通过性能验证形成实验室最优的检测系统，建立具有可操作性的SOP。