分子诊断技术—突发性呼吸道传染病应急防控处置管理与培训

基因扩增技术

1983年，Muis发明了具有跨时代意义的聚合酶链反应（PCR）技术，实现了体外扩增核酸片段的愿望。核酸扩增技术以其特异、快速和灵敏的优势，广泛应用于医学、农业、食品领域。

1.常规PCR技术

常规PCR是在PCR扩增反应结束后对产物进行电泳或杂交的方式分析，因其技术平台要求较低、花费较低等特点，目前临床上多应用该平台对定性项目进行检测，如Y染色体微缺失检测、HLA位点分型检测、融合基因检测、甲基化检测等项目。同时，等温扩增技术、信号放大技术等一批新颖的技术在分子诊断定性项目中也得到越来越多的应用。

2.实时PCR技术

又称荧光PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，实时监测整个PCR反应进程中的荧光信号改变，最后通过标准曲线对模板进行分析的方法，如扩增阻碍突变系统法（ARMS）和PCR高分辨熔点曲线法（HRM）。荧光PCR技术因其特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化的优点，临床上广泛应用于核酸定量、mRNA表达水平分析、基因突变分析领域。目前，以TaqMan荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，在国内的传染病诊断中应用最为广泛。在Holland及其同事的研究中，发现热稳定TaqDNA聚合酶在具有5′→3′方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5′→3′核酸外切酶活性。于是，在PCR过程中，TaqDNA聚合酶可利用其5′核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针。利用TaqDNA聚合酶的这一特性，可以检测靶序的扩增。用荧光标记寡核苷酸探针的5′端，探针的3′末端设计为不能延伸以防其成为PCR扩增的引物，扩增中，当引物通过TaqDNA聚合酶的聚合反应延伸至接近与靶核酸序列结合的探针时，TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性即能将探针降解成小片段，然后通过薄层层析将这些小片段与未降解探针分开，探针降解得越多，扩增的产物也越多，从而指示靶核酸的存在及量。使用荧光基团和淬灭基团的TaqMan荧光探针，即在其5端标记一个荧光报告基团，如6-羧基荧光素（FAM）、四氯6-羧基荧光素（TET）、六氯6-羧基荧光素（HEX）等，3端有一个淬灭剂，如6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）根据荧光共振能量传递（FRET）原理，完整探针因荧光基团和淬灭基团距离很近而使荧光基团发射的荧光被淬灭，只有当探针降解时，荧光报告基团和淬灭基团分离，这时荧光才能发射出来（图3-30）。

图3-30　实时PCR检测技术的基本原理

基于上述荧光PCR的原理，使用实时荧光PCR仪实时检测荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系，扩增仪软件系统可自动计算得到图3-31的实时扩增曲线。

图3-31　实时荧光PCR扩增曲线

图中基线是指荧光信号积累但低于仪器的测定限之下的PCR循环。仪器软件通常将基线设为3～15循环时的荧光信号，但通常需要人工设置。阈值是计算机根据基线的变化所任意选择的，是指3～15个循环的基线荧光信号均值标准差。(www.xing528.com)

3.基因测序技术

1977年，Sanger等发明了脱氧核糖核酸（DNA）双脱氧链末端终止测序法，以检测细胞最小单位的碱基为目标，随着基因组计划的完成，通过与基因库的比对，从中发现被测物的特性，因此基因序列分析目前是分子诊断的金标准，并广泛应用于疾病的诊断与治疗。

（1）Sanger测序技术

Sanger双脱氧链末端终止测序法作为经典的测序技术，该技术读取序列长，能够较好地处理重复序列和多聚序列，在基因组DNA测序、cDNA测序、未知序列测序、基因突变检测方面有着广泛的应用。但该技术也存在灵敏度较低、通量低等不足。

（2）高通量测序技术

高通量测序技术是对传统测序的一次革命性改变，一次可以对几十万条甚至几百万条DNA分子进行序列分析。目前主要有焦磷酸测序平台、单分子合成测序法平台、连接测序法平台和半导体测序平台。高通量测序技术有着传统测序技术不可比拟的优势，可以进行大规模平行测序，灵敏度比一代测序法高，且平均单个碱基测序成本低廉。高通量测序技术不仅可以进行全基因组测序，还可用于宏基因组测序、转录组测序、外显子测序、小核糖核酸（RNA）测序、DNA甲基化分析等相关方面的研究。

4.分子杂交技术

分子杂交是指具有同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸杂交技术是从1961年Hall等人的工作开始的，其后衍生了许多相关技术。例如，菌落原位杂交、斑点杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、荧光原位杂交和芯片杂交。

（1）原位杂交技术

原位杂交技术是利用碱基互补配对的原则，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。原位杂交技术有荧光原位杂交技术（FISH）、多色FISH技术、显色原位杂交技术（CISH）、引物原位标记技术（PRINS）、基因组原位杂交（GISH）技术等。原位杂交技术在微生物诊断、产前诊断基因定位、癌症基因检测和判断方面应用广泛。

（2）芯片技术

基因芯片又称DNA微阵列，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列在载体表面，通过核酸杂交检测DNA序列的技术。常见的技术平台有固态芯片、液态芯片等。芯片技术的主要特点是高通量、并行性、高灵敏度、微型化、自动化。基因芯片在SNP检测、基因分型、药物筛选、产前诊断、司法鉴定方面均有应用。