传染病医院感染防控实用手册——寄生虫病检验操作规程

一、操作规程

（一）方法原理

对于寄生虫感染的诊断，病原学诊断方法是首选，也是确诊的依据。在送检的标本中，采用适合的检查方法找到寄生虫任何的寄生阶段都可确诊。

（二）检测样本类型

检测样本为粪便、尿、痰、阴道分泌物、外周血液、骨髓、脑脊液和某些寄生部位组织等。

（三）仪器设备

显微镜、离心机、高压蒸气灭菌器等。

（四）试剂耗材

生理盐水、保存剂、玻片、染色液、固定剂等。

（五）操作步骤

1.直接涂片法：常用方法有生理盐水涂片法和碘液染色涂片法，前者适用于蠕虫卵和原虫滋养体的检查，后者适用于原虫包囊的检查。在洁净的载玻片中央加一滴生理盐水，用竹签挑取绿豆大小的粪便，在生理盐水中调匀涂开，涂片厚度以透过玻片可隐约辨认书上字迹为宜，盖上盖玻片镜检。先在低倍镜下按顺序查找，再换用高倍镜观察细微结构。检查原虫包囊时，以碘液代替生理盐水，或在生理盐水涂片上加盖玻片，然后从盖玻片一侧滴碘液一滴，待其渗入后观察。

2.血膜染色法。

（1）血膜的制备：制作血膜的载玻片需用清洁液清洗，自来水、蒸馏水冲洗，95%酒精浸泡，烤干后使用。

薄血膜的制备：取一清洁载玻片，蘸血1小滴于载玻片1/3与2/3交界处，以一端缘光滑的载玻片为推片，将推片的一端置于小血滴上，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。推片时使两玻片之间的夹角保持30°～45°，用力要均匀，速度适宜，中途切勿停顿。理想的薄血膜是一层分布均匀的血细胞平铺于玻片上，无裂缝和空隙，血膜末端呈舌形。

厚血膜的制备：厚血膜可涂制于上述薄血膜的另一端。在载玻片另一端1/3处蘸血1小滴（约10uL），以推片的一角，将血滴自内向外旋转摊开，涂成直径约1.0cm且厚薄均匀的血膜。平置，自然晾干。检查微丝蚴时，需取血3滴（约60uL），血膜直径达到2cm。

（2）固定和染色：血膜制备后应尽快染色，常用的染色法有两种：吉姆萨染色和瑞特染色。建议血片标本采用吉姆萨染色，有些寄生虫也可用瑞特染色或瑞特-吉姆萨混合染色。在稀释各种染液和冲洗血膜时，如用磷酸缓冲液则染色效果更佳。

染色前血片固定：血片充分晾干后用小玻棒蘸甲醇或无水酒精在薄血膜上轻轻抹过进行固定。如薄、厚血膜在同一玻片上，须注意切勿将固定液带到厚血膜上。厚血膜固定之前必须先进行溶血，可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。

吉姆萨染色法：用pH7.0～7.2的磷酸缓冲液稀释吉姆萨液，比例约为15～20份缓冲液加1份染液。用蜡笔划出染色范围，将稀释的吉姆萨染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小时（室温），再用上述缓冲液冲洗。血片晾干后镜检。

瑞特（瑞氏）染色法：染色前先用蜡笔划好染色范围，滴染液覆盖全部厚、薄血膜上，30～60s后用滴管加等量的蒸馏水，轻轻摇动载玻片，使蒸馏水和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜（染色），3～5min后用水缓慢地从玻片一端冲洗（注意勿先倒去染液或直对血膜冲洗），晾干后镜检。

3.结果报告：所有查见的寄生虫都应报告，需指出具体时期并报告所鉴定虫体的完整种名和属名。

二、人员防护

为了防止在采集标本过程中寄生虫的感染。除应具备必要的寄生虫基础理论知识外，还要采取必要的防护措施。按不同寄生虫生物安全防护等级要求使用相应的防护用品和设备，做好实验人员手部、身体、面部、足部等的防护，正确使用手套、口罩、工作帽、护目镜、洗眼器、防护服等防护用品，以达到防护目的。例如在进行尸体和动物解剖时，要戴上口罩、护目镜与乳胶手套，穿好防护工作服。当解剖完毕，须将解剖用具和试验台清洗消毒，以免污染或传播。如当解剖钉螺或用钩蚴接种动物时，应当特别注意血吸虫尾蚴或钩蚴侵入皮肤的可能。如在采集病媒昆虫标本时，应注意防止吸血节肢动物如蚊、蛉等叮咬，可在皮肤上涂擦驱避剂或穿防护服。如在啮齿动物体上采取蚤、螨等标本时，更应严密防止虫体散播侵袭人体并发生传播疾病的可能。(www.xing528.com)

三、标本采集及处理

（一）粪便标本

1.嘱患者将粪便排于清洁便盆内，用检便匙在粪便不同的部位采集带血或黏液部分，量约5～10g，放入便盒内，立即送检。

2.粪便标本的采集受某些物质和药物的影响，包括钡餐、矿物油、铋、抗菌药物（甲硝唑、四环素）、抗疟药物及无法吸收的抗腹泻制剂。当服用了以上药物或制剂后，可能在一周或数周内无法检获寄生虫。因此，粪便样本应在使用钡餐前采集，若已服用钡餐，采样时间需推迟5～10天。服用抗菌药物则至少停药2周后采集样本。为提高阳性检出率，推荐在治疗前送3份样本进行常规粪便寄生虫检查，3份样本应尽可能间隔1天送1份，或在10天内送检，并在运送途中注意保温。

3.新鲜粪便样本应置于清洁、干燥的广口容器内，容器不能被水、尿液、粉尘污染。可疑诊断及相关的旅行史有助于实验室诊断，应尽量记录在申请单上。

4.如果粪便样本排出后不能及时检查，则要考虑使用保存剂。为了保持原虫的形态及阻止蠕虫虫卵和幼虫的继续发育，粪便样本可在排出后立刻放入保存剂，充分混匀后放置于室温。

（二）血液与骨髓标本

1.血片可以采集末梢血或静脉血，用新鲜全血、抗凝血（推荐使用EDTA抗凝）或各种浓集沉淀物来制备。

2.末梢血的采集部位可选手指末端、耳垂、婴儿脚趾或脚后跟。采血针刺破手指后，让血液自行流出而不要用手挤压，以避免血液被组织液稀释而使样本中的虫数减少。对疑似疟原虫感染的患者，首次血涂片结果为阴性时，应在3天内每间隔6～8h采样进行检查。注入抗凝管中的血量应保证使血/抗凝剂有正确的比例。

3.血液样本的采集时间应清楚地标示于采血管上以及结果报告单上，以便医生能将实验室结果与患者的发热类型或其他症状相联系。

4.骨髓标本常采用髂骨穿刺或棘突穿刺，抽取少许骨髓液涂片、固定、吉姆萨染色、镜检。

四、实验室消毒

实验室空气消毒可采用加强通风或紫外线照射的方法。地面和物体表面消毒可采用1000～2000mg/L含氯消毒液或0.2%～0.5%过氧乙酸喷洒、擦拭。当有污染物溢出时，应使用消毒剂覆盖浸没污染物，保持30～60min。每次使用生物安全柜消毒前后用75%酒精或1000～2000mg/L含氯消毒液擦拭工作台面、四周以及玻璃的内外侧等部位来清除表面的污染。当显微镜局部轻度污染时，应用75%医用酒精擦拭2次。此外，当突发事故或意外泄露导致生物或化学材料污染设备时，应及时对每件设备用75%酒精或其他适当消毒剂浸泡过的湿巾擦拭干净，然后彻底消毒。必要时，关闭受污染房间，用紫外线照射消毒30min以上。粪便涂片及血涂片镜检完成后必须放入之前配制好的含氯消毒剂中浸泡30min以上。

五、废弃物处置

实验室废弃物含有大量的致病性病原体和其他有害物质，如果管理不严，处理不当，非常容易造成实验室环境污染和导致传染性疾病传播。

（一）对实验室废弃物进行分类收集

1.实验过程中的感染性废物：虫卵、包囊、各种寄生虫感染标本、人工感染的动物的排泄物、尸体、各种废弃的血液、分泌物、实验过程中使用过的一次性用品等应弃置于专用的有生物危险标识的处置危险废物的黄色容器内。

2.实验过程中产生的污染性液体物质、废弃的液体标本、培养物等应使用盛有消毒液的严防渗漏的有标识的专用容器收集，并及时加盖。

3.实验中产生的损伤性废物：针头、玻璃试管、载玻片等应直接弃置于耐扎容器内， 并加盖密封。

（二）对实验室废弃物进行处理

在实验室内所有弃置的实验室生物样本、培养基和被污染的废物在从实验室中取走之前，应高压消毒处理，使其达到生物学安全标准。实验室废物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。废弃物应按规定统一存放，统一处理。