结核杆菌检验操作规程与医院感染防控手册

一、操作规程

（一）涂片查抗酸杆菌

1.方法原理：分枝杆菌属是一类细长略弯曲，有时有分枝或出现丝状体。分枝杆菌属的细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，所以分枝杆菌一般不易着色。分枝杆菌一般用萋-尼氏抗酸染色法，在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

2.检测样本类型：检测样本包括痰、胸水、腹水、尿液、脑脊液、脓液（分泌物、穿刺液）等临床标本和分枝杆菌培养物。

3.仪器设备：生物安全柜、离心机、高压蒸气灭菌器、冰箱、光学显微镜等。

4.试剂耗材：萋-尼氏染色液、磨砂载玻片、竹签、2B铅笔、镜油、染色架、玻片盒等。

5.操作步骤。

（1）使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片，经95%酒精脱脂，干燥、清洁后备用。

（2）用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号。确保玻片的编号与痰盒上的编号相同。

（3）在生物安全柜中，小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时对载玻片进行加热。

（4）仔细观察标本，使用折断的竹签毛茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05mL，于玻片正面轻轻环状均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜。

（5）痰膜朝上静置在生物安全柜中自然干燥（同时打开生物安全柜内的紫外灯，对痰膜进行紫外线照射消毒，一般约需要30min）。

（6）其他类型临床标本，如脑脊液、胸腹水、24h尿液、灌洗液等体液标本取5～10mL于刻度离心管以3000g离心15～30min后取沉淀涂片，涂片后自然干燥。

（7）涂抹完毕后的标本，在结果报告前应暂时保留。

（8）抗酸染色：

①固定：涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上的距离。加热固定（在5s内将玻片经过火焰加热4次）。

②初染：滴加石炭酸复红染液盖满痰膜，加热至出现蒸气后，停止加热，保持染色5min。加热时勿使染色液沸腾。

③水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去玻片上剩余的水。

④脱色：自痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片，脱色1min。脱色至痰膜无可视红色为止。

⑤水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。

⑥复染：滴加亚甲蓝复染液，染色30s。

⑦水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去玻片上剩余的水。待玻片干燥后镜检。

（9）显微镜检查：一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观为亮蓝色，无红色斑块。首先使用“40×”物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态。移开“40×”物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用“100×”油镜进行细致观察。但应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。读片时，首先应从左向右观察相邻的视野。当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。

（10）结果判读：在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色。其他细菌和细胞呈蓝色。镜检所见结果按下列标准报告：

①抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

②抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野。

③抗酸杆菌阳性（1+）：3～9条/100视野。

④抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/10视野。

⑤抗酸杆菌阳性（3+）：1～9条/每个视野。

⑥抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每个视野。

标本性状分别为血痰、干酪痰、黏液痰和唾液。痰涂片镜检完毕后用擦镜纸擦干玻片上的镜油，把玻片存放到编号对应的玻片盒内，并在痰涂片检查登记本上记录患者信息结果。

（二）分枝杆菌快速液体培养

1.方法原理：BACTEC MGIT 960，是通过检测液体培养基中消耗氧气（O2）的量来确定是否有细菌生长。MGIT培养管底部包埋有荧光物质，荧光物质将随着管内氧含量的变化而发生反应。若分枝杆菌在MGIT培养管内生长消耗氧，管内荧光物质被激活，在特定光源的激发下释放荧光。BACTEC MGIT 960系统将每隔60min连续检测MGIT培养管内荧光强度，从而判断MGIT管内分枝杆菌长情况。该方法阳性检出时间明显缩短，从常规培养8周缩短到3～14天。如果6周（42天）之后，该仪器仍为阴性，则表示培养管为阴性。

2.检测样本类型：检测样本包括痰、胸水、腹水、尿液、灌洗液等。

3.仪器设备：Ⅱ级生物安全柜、离心机、恒温培养箱、高压蒸气灭菌器、BACTEC MGIT960全自动培养仪等。

4.试剂耗材：4%氢氧化钠（NaOH）溶液、50mL离心管、2mL无菌吸管、MGIT 7mL培养管、生长添加剂等。

5.操作步骤。

（1）痰标本留取1～2mL，其他标本取5～10mL于刻度离心管以3000g离心15～30min后留沉淀物于刻度离心管内，并在管壁上标注编号和日期。

（2）加入4%NaOH 5～7mL并用竹签打磨至痰液完全液化（液化过程控制在15～20min），平衡离心管后于3000g离心15～30min。

（3）取出离心管后弃上清液，加灭菌PBS缓冲液2～3mL，混匀，3000g离心15～30min。取出离心管后弃上清液，再加灭菌PBs缓冲液1～2mL，充分混匀。

（4）向培养管中加入0.8mL营养添加剂/杂菌抑制剂混合物，用移液器取0.5mL处理后的标本液加入MGIT培养管内，仪器自动培养并报告阴性、阳性结果。

（三）结核分枝杆菌DNA检测

1.方法原理：采用荧光PCR法，选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合。在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5′端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3′端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，实现在全封闭反应体系中对结核分枝杆菌核酸的自动化检测。

2.检测样本类型：检测样本为痰液。

3.仪器设备：荧光定量PCR仪、核酸提取仪、生物安全柜、离心机、涡漩震荡混合器、移液器、高压蒸气灭菌器等。

4.试剂耗材：结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒、核酸提取试剂盒、带滤芯Tip头、2mL EP离心管、移液器和PCR专用反应管、反应板及相应的荧光定量PCR专用反应盖、封板膜等。

5.操作步骤。

（1）反应体系配制：遵照试剂盒说明书进行配制，商品化试剂盒一般由预混反应液以及酶、探针等组成，按照说明书要求配制即可。

（2）标本处理及提取：痰液中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30min左右液化，取1～1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，去上清，沉淀加无菌生理盐水200uL打匀，取200uL加入提取试剂深孔板第一列和第七列，使用核酸提取仪进行提取得到核酸提取产物，位于深孔提取板第六列和第十二列。(www.xing528.com)

（3）PCR扩增：将建立好的扩增体系放入扩增仪对应反应孔内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控、标准品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件。95℃→3min变性，1个循环，然后按94℃15s→60℃30s（此步骤采集荧光信号），40个循环。

（4）结果分析条件的设定：条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节阈值，最后仪器自动分析计算出Ct值。

（5）质量控制。

阴性质控品：增长的曲线不呈“S”型或Ct值为空白。

阳性质控品：增长曲线呈“S”型，且强阳性质控品定量参考值在1×106基因拷贝/mL～2×107基因拷贝/mL范围，临界阳性质控品定量参考值在2×102基因拷贝/mL～2×104基因拷贝/mL范围。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差，需重新进行。

（6）结果的解释。

阴性结果判定：如果定量值＜5.000E+02，则实验结果为阴性。

阳性结果判定：如果定量值＞5.000E+02，则实验结果为阳性。

二、人员防护

（一）不同实验操作生物安全实验室级别要求

1.根据《人间传染的病原微生物名录》的规定，在实验操作涉及结核杆菌的大量培养、结核杆菌离心冻干等易产生气溶胶的实验操作以及以结核杆菌活菌感染的动物实验，应在BSL-3或ABSL-3实验室进行。

2.临床样本的结核杆菌分离培养、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动可在BSL-2实验室进行。

3.对经有效方法灭活后不含结核杆菌活菌材料的分子生物学、免疫学等实验可在BSL-1实验室进行。

（二）个人防护装备

1.个人防护用品是减少操作人员暴露于气溶胶、飞溅物和意外接种风险的屏障。应根据实验的性质选择个人防护用品。任何实验室操作都必须做好个人防护。离开实验室前，实验人员应脱去防护用品并进行手卫生。

2.个人防护用品主要包括工作帽、医用防护口罩、实验室工作服、护目镜、手套、鞋套、隔离衣/防护服、呼吸面罩等。工作帽、口罩应符合国家相关标准。手套是经过微生物防护认证的一次性乳胶、乙烯基手套等。实验室工作服一般为长袖，前系扣，进行结核感染风险较低的操作时穿着。隔离衣应为长袖，有弹性袖口（长度至少30mm），隔离衣为后开口。防护服为前拉链式开口。

3.隔离衣和防护服的使用：主要用于人体与外部环境的隔离，安全作业。

4.呼吸防护用具的使用：用于职业性呼吸防护，阻隔感染性微生物颗粒（如病毒、细菌、霉菌、炭疽杆菌、结核杆菌等）进入呼吸系统，保证呼吸安全。

5.手套的使用：预防样本、试验物品上的病原微生物传播给实验室人员。

6.鞋套和工作鞋的使用：清洁区或潜在污染区进入污染区时应穿鞋套或换工作鞋，离开污染区应脱去鞋套或换工作鞋。

7.工作帽的使用：结核分枝杆菌相关检测试验时均应佩戴。

8.手卫生：结核病实验室工作人员应熟悉手卫生指针并严格执行手卫生。适用范围：结核分枝杆菌相关检测试验前后。

9.处理结核分枝杆菌活菌时，应先对结核菌室进行紫外线消毒30min以上，实验室人员穿好个人防护用品后，开启负压系统（有条件的情况下）方能进入结核菌室，再开启生物安全柜，所有操作均需在生物安全柜内进行。

10.依据不同实验操作生物安全实验室级别要求，进行不同级别的个人生物安全防护。

三、标本采集及处理

1.肺结核患者或者可疑者留取痰标本的过程极易产生气溶胶，容易发生结核分枝杆菌的暴露，相关医务人员应采取必要的隔离防护措施。

2.肺结核患者应在留痰室或者空旷的室外区域留取痰标本。

3.医务人员指导患者正确留痰。

4.协助采集痰标本或者执行诱痰操作的医务人员应佩戴医用防护口罩、手套或者其他必要的个人防护用品。

5.采痰结束后，应注意现场的清洁、通风和消毒。

6.痰标本应留置在带盖的痰标本盒内，在运送过程中避免泄漏。

四、实验室消毒

1.严格执行无菌操作规程，采血必须一人一针一管一带一纸，操作前应洗手或手消毒，感染患者标本要专室、专台、专人操作。

2.无菌物品（纱布、棉签等）及各种消毒剂应在有效期内使用。

3.保持实验室整洁，定时开窗通风，实验室每日用紫外线照射消毒1h以上。

4.每日对检验台面、椅子、门把手等物品表面用500mg/L含氯消毒液擦拭，进行常规消毒，被血液污染的台面用1000～2000mg/L含氯消毒液随时消毒，并做到卫生用具专室专用。

5.每天工作结束后立即用500mg/L含氯消毒液拖地，被血液、体液污染的地面用1000～2000mg/L含氯消毒液随时消毒，并做到卫生用具专室专用。

6.实验室产生的病原体的培养基、标本和毒（菌）种保存液等实验室废弃物放入双层黄色包装袋，经高压蒸汽灭菌后按照医疗废物处置。

7.使用后的一次性医疗用品按医疗废物相关规定处理。

五、废弃物处置

1.在结核分枝杆菌相关检测实验室中有直接或者间接感染性、毒性以及其他危害性的废物均需按照《医疗废弃物管理条例》（GB19489—2008）的规定进行废弃物处理。

2.对于医疗废弃物应进行分类收集处理，杜绝医疗废物与生活垃圾混合收集的现象存在。感染性废弃物应置于带有生物安全标识的专用塑料袋内密封运送、高压处理，消毒后运送和无害化处理。医疗机构要按照条例要求建立医疗垃圾分类收集、专人管理制度，并加上识别标志。

3.携带或疑似携带结核菌的废弃物均应按照感染性废弃物进行处理。最常用的也是有效的处理方法为高压蒸气灭菌法，适用于固体或液体废弃物。灭菌条件为121℃条件下，维持15～30min。

4.废弃物应当天处理。收集未高压灭菌的废弃物，应佩戴适宜的防护面屏、工作服、工作帽、手套等，收集后尽快高压灭菌。

5.每次高压灭菌处理废弃物均应填写废弃物处理记录，保存记录备查。

6.高压时应使用高压检测试纸或其他方法检测高压效果。