14个胆固醇代谢基因敲除乐无边

要点　通过基因敲除技术，人们可以将鼠体内影响胆固醇代谢的基因敲除，再给鼠喂食胆固醇，则可使鼠在短时间内发生动脉粥硬化。

20世纪80年代以来，在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术基础上，逐渐发展出一种新分子生物学技术，即基因敲除（gene knockout）。基因敲除通过同源重组，将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰和改造染色体上某一基因的目的。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰和改造生物遗传物质的方法。通俗地说，基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，第一种基因敲除动物模型是基因敲除小鼠，方法是先通过基因重组的办法对小鼠的胚胎干细胞进行基因修饰，改变胚胎干细胞中的靶向基因，然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠，即基因敲除小鼠。这种目标基因的靶向敲除，将导致该基因相关的生物功能丧失，从而使小鼠出现该基因功能缺失后的生物学表征。因此，基因敲除成为研究目标基因生物学功能的重要手段。

我们已经知道，自然状态下鼠类进食富含胆固醇和脂质的食物并不会发生动脉粥样硬化。这是因为长期的自然进化使得鼠代谢胆固醇的能力异常强大，能迅速和有效地把摄入的大量胆固醇或脂质代谢出体外，从而防止血液中的胆固醇水平过高，避免了动脉粥样硬化发生。而通过基因敲除技术，我们可以去除鼠体内影响胆固醇或脂质代谢的相关基因，人为地降低和抑制鼠代谢胆固醇的能力，这样就可以诱导鼠发生动脉粥样硬化，从而建立相应的基因敲除鼠动脉粥样硬化模型。

最常用的两种基因敲除鼠动脉粥样硬化模型是载脂蛋白E（Apo E）基因敲除鼠和低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因敲除鼠（图14-1）。Apo E是极低密度脂蛋白（VLDL）、乳糜微粒和高密度脂蛋白（HDL）的主要成分，参与胆固醇逆向转运，通过LDL-R途径和非LDL-R途径发挥清除体内胆固醇的作用，降低血浆中的胆固醇水平，防止动脉粥样硬化发生。Apo E缺失的人和小鼠，由于Apo E依赖的LDL-R途径和非LDL-R途径受阻，导致总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和VLDL含量显著升高，从而诱发动脉粥样硬化。LDL-R是血浆中重要的胆固醇运输蛋白，通过与载脂蛋白B（Apo B）和Apo E结合，介导含有Apo B或Apo E的低密度脂蛋白（LDL）、VLDL和中间密度脂蛋白（IDL）的清除，降低血浆中的胆固醇水平。因此，LDL-R缺失的人和小鼠，由于LDL、VLDL和IDL等脂蛋白清除受阻，使血浆中的胆固醇水平显著升高，导致发生动脉粥样硬化。由此可见，Apo E和LDL-R是鼠类负责体内胆固醇代谢的重要因子，Apo E基因和LDL-R基因被敲除后均会导致血胆固醇水平显著升高，诱发动脉粥样硬化，因此，Apo E和LDL-R可视为动脉粥样硬化的保护因子。

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图14-1　敲除小鼠Apo E或LDL-R基因后诱发动脉粥样硬化

Apo E基因敲除小鼠模型于1992年由美国洛克菲勒大学和北卡罗莱那大学的科学家培育成功。该小鼠模型无论是正常或高脂饮食均可形成严重的高脂血症，其血胆固醇含量为正常水平的5倍，Apo B水平是正常水平的3～6倍，并且随小鼠年龄增长而显著升高。Apo E基因敲除小鼠10周龄即可在主动脉、冠状动脉及肺动脉发生动脉粥样硬化病灶；3月龄时近端主动脉即出现大量泡沫细胞沉积；至8个月时冠状动脉口处就会因为粥样硬化斑块的发展而形成严重的闭塞。研究发现，给Apo E基因敲除小鼠分别予以普通饮食和高脂饮食后，15周龄普通饮食组小鼠出现内膜增厚和脂质沉积，但血管管腔内径未见异常；19周龄普通饮食组小鼠有明显的脂质条纹块形成，此为纤维斑块形成的过渡前期，而15周龄和19周龄高脂饮食组小鼠均有斑块形成；24周龄普通饮食组和高脂饮食组小鼠全部有斑块形成；28周龄普通饮食组小鼠的斑块在大小、程度上介于高脂饮食组19周龄和24周龄之间，28周龄高脂饮食组斑块与24周龄相比，纤维帽变薄、泡沫细胞堆积、部分破裂；36周龄普通饮食组斑块程度类似于28周龄高脂饮食组，而36周龄高脂饮食组粥样硬化斑块进展明显，大量泡沫细胞崩解，深部为大量无定形坏死物质，斑块破裂、管腔狭窄明显，严重者达70%～90%。

LDL-R基因敲除小鼠于1993年由科学家采用基因工程技术从胚胎干细胞中成功培育，该小鼠在给予含10%脂肪的饲料饲养后血脂水平可升高两倍，VLDL清除率明显减低，其中LDL和IDL水平增加7～9倍，而HDL水平变化不明显。相比Apo E基因敲除小鼠，LDL-R基因敲除小鼠的血胆固醇水平稍低（但仍然高于正常小鼠），一般需要采用高脂饮食喂养以诱发动脉粥样硬化。

此外，还有一种LDL-R/Apo E双基因敲除小鼠，即同时敲除Apo E和LDL-R两种基因，由于Apo E和LDL-R均是鼠类负责胆固醇代谢的重要因子，所以这种双基因敲除小鼠的血浆总胆固醇、LDL-C和甘油三酯水平均高于Apo E或LDL-R单基因敲除小鼠，也更容易发生动脉粥样硬化（图14-1）。

由此可见，通过现代基因敲除技术，靶向敲除鼠体内负责胆固醇代谢的基因（如Apo E或LDL-R）后，鼠类同样会因为体内胆固醇的代谢障碍导致血胆固醇水平显著升高，最终发生动脉粥样硬化。这也提示，只要能够升高小鼠血浆中的胆固醇水平，便能够诱发这种动物的动脉粥样硬化。这就再次证实了胆固醇是动脉粥样硬化的根本病因。