荧光标记的应用及技术分析

STR荧光标记检测技术，指将荧光染料标记到其中一个引物（一般选正链）的5′端，使随后的每一个PCR扩增产物都带有一个荧光染料分子。荧光的作用，便于被扫描仪器识别和记录。目前，STR检验主要应用多色荧光标记复合扩增毛细管电泳自动检测技术。

荧光素的种类很多，用于标记引物进行DNA分析的荧光必须满足以下要求：①荧光素的吸收光谱应在激光束所提供的可见光区内；②荧光基团发射光谱波长间应有足够的差异；③发射出的荧光应有足够的强度以达到检测器的灵敏度；④荧光基团的存在不应影响PCR延伸反应，如引物退火和dNTP底物掺入等反应过程；⑤DNA片段被标记荧光基团后，不应改变在电泳中的迁移速率，或荧光基团标记后的DNA片段迁移速率的变化应保持一致。

这种带有荧光分子的DNA片段在电泳时从阴极向阳极迁移，速度按片段分子量由小到大排列。当片段通过到阳极端的激光扫描窗口时，荧光染料分子的共轭双键受到激发，发出一定波长的荧光，被扫描仪电荷耦合器（CCD）成像接收。每一个带荧光染料的DNA片段按各自通过激光扫描窗口的实际时间被记录下来，出现一个荧光吸收峰值。以荧光峰值来表示每一个片段，峰值高低与扩增片段数量正相关。而峰值出现的时间与片段大小正相关，片段小，出现峰值时间短。

根据同一泳道内标准分子量（简称为内标）的迁移率得到每一泳道迁移率的标准曲线，计算出待测样品的分子量大小，应用ABI3130XL型基因分析仪片段分析精确度可达0.5 bp。利用片段分析软件将测定的样品片段大小与同一批加样的等位基因标准物（ladder）的片段大小对比，就能知道所检测到的DNA片段的等位基因名称，也就是DNA的分型结果。

这种复合检测体系可以同步检测多个STR基因座，可以根据等位基因片段所带的荧光颜色不同加以区别，即使等位基因片段长度有重叠的基因座，也可采取不同的荧光标记，区分不同基因座的等位基因。

常用的荧光染料有6-FAM、HEX、TAMRA、NET、ROX、CY3、CY5、LIZ、SIZ等。(www.xing528.com)

（1）6-FAM：6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。

（2）HEX：5-hexachloro-fluorescein，又名5-六氯荧光素氨基磷酸酯，激发光波长535 nm，发射光波长553 nm。

（3）TAMRA：羧基四甲基罗丹明。

（4）ROX：6-ROX主要是用于标记核苷酸和核酸测序。相比其他罗丹明类荧光染料，ROX很不稳定。

（5）分子量内标，采用第五色荧光染料SIZ标记。