有机溶剂法提取DNA——Y-DNA检测在刑事侦查中的应用

DNA的提取方法较多，如酚/三氯甲烷/异戊醇法、尿素提取法、氯化锌法、三乙醇月桂基硫酸盐法、碘化物法、直接煮沸法等。

以下以酚/三氯甲烷/异戊醇法为例：

酚/三氯甲烷/异戊醇法：通过酚-三氯甲烷混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中，适用所有生物检材。其提取DNA量比Chelex100法和无机盐提取法多，且DNA分子结构完整。

（1）样本：人外周静脉抗凝血。分别采集外周静脉血5 mL，2%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝，待用（要求采血至分离白细胞间隔时间在室温下放置不超过2 h，4℃放置不超过5 h，避免白细胞自溶）。(www.xing528.com)

（2）仪器设备与试剂：①采用1.5 mL离心管及最高转速13 000 r/min的微型高速离心机；②5～100℃可调、误差小于1℃的56℃干热器；③10μL、100μL、1 000μL可调、误差小于1μL的移液器；④1×SSC溶液，0.2 mol/L和2 mol/L乙酸钠，10%SDS，20 mgL/mL蛋白酶K，酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25∶24∶1）；⑤1×TE溶液，包括70%和100%乙醇。

（3）步骤：①采集血样放入含有EDTA真空管，使用前充分混匀。取1.5 mL带盖微型离心管吸700μL血样冷冻保存备用。②37℃培育冷冻血样，加1×SSC800μL混合。离心，13 000 r/min，1 min，弃上清液。③加1.0 mL1×SSC振荡，离心，13 000 r/min，1 min，弃上清液。注意避免触动沉淀物团。④加375μL0.2 mol/L乙酸钠，振荡使沉淀物悬浮，加10%SDS 25μL和蛋白酶K 5μL，旋涡振荡，56℃培育1 h。⑤加等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇，旋涡振荡30 s。⑥微型离心机上2 000 r/min，离心2 min。⑦仔细吸取水相转移到另一新的1.5 mL微型离心管。注意避免吸到在分界面上积聚的变性蛋白，弃去剩余酚和变性蛋白。⑧加1μL100%冷乙醇，倒转混匀，置于-20℃冰箱15 min。⑨加180μL 1×TE，旋涡振荡使沉淀物团散开，56℃孵育10 min。加入20μL 2 mol/L乙酸钠，倒转混合5 s。⑩加500μL100%冷乙醇。轻轻地混匀，使之成为均一溶液。2 000 r/min离心5 min。弃去上清液。⑪用1 mL室温70%乙醇清洗沉淀物团。2 000 r/min离心5 min。用微量移液器尽可能移去上清液，切勿打乱沉淀物团。⑫真空干燥沉淀物团。此步骤应在约5 min完成，不能过干，避免DNA不再溶解。⑬加200μL1×TE混合，56℃孵育过夜。次日晨，旋涡振荡10 s。