优化数字全息显微中的光学显微基础

5.2.1.1　物镜

在显微镜中，物镜明显是最重要的元件。三种主要类型像差的校正情况决定了物镜的好坏等级：球差、色差、场曲。轴上色差需要对两种波长进行校正：红光（656 nm）和蓝光（486 mm），而球差需要对绿光进行校正（546 mm）。平面色差校正还需要校正场曲像差。萤石透镜需要在两个或者三个波段校正色差和球差。平面萤石透镜还要校正场曲，而平面复消色差透镜需要进行最高程度的像差校正，需要对四个或者五个波长进行校正。当采用合适的液体，例如浸油（折射率为1.515）或者浸水（折射率为1.333）透镜，可以达到较高的NA值，并因此能够提高分辨率。采用这些物镜的同时还必须使用标准盖玻片（厚度为170 um，折射率为1.515），目的是为了保持原来的像差校正情况。特殊目的物镜被用于各种显微技术中，例如干涉显微、相衬显微、扫描共焦显微。

5.2.1.2　眼睛光学系统

对于目视观察，眼睛也成为光学成像系统的一部分。理想情况下，目镜的出瞳（即眼点口径）要与眼睛的瞳孔相耦合。虽然视觉过程包含视觉皮质的复杂处理过程，而且实际的视力会有巨大变化（会高于或低于物理限制），但是视觉分辨率或者视力会受到大约5μm视网膜感光细胞空间的制约（即相当于从角膜到视网膜的25 mm距离处，所夹张角为0.7弧分）。那么对于在250 mm距离处的一个物体，实际分辨率大约为50μm。这就引出了样本平面的最小可分辨距离为50／Mum，这个值需要比物镜的分辨率大一些。那么最大有用放大倍率Ma约为200μm，超出这个范围放大倍率就被认为是无效的。

5.2.1.3　相机

对于数字成像的情况，CCD相机就代替了眼睛的作用。由于大量的重要优势，数字成像已经大部分取代了传统的胶片成像，其优势包括：视觉反馈的即时性、定量成像测量、高灵敏度、大量的图像处理技术，这些优势也是数字全息技术开发和应用快速增长的原因。作为成像系统中的一个关键元件，需要考虑CCD相机大量的操作参数，包括空间像元分辨率、灰度分辨率、帧频、动态范围和噪声。

5.2.1.4　亮场显微(www.xing528.com)

这是标准光学显微中最普通的成像模式，其中光束从大部分的视场透射或者反射穿过，透射或反射的变化就是对比度。基本原理大概相似，而且操作过程相对简单。还可以使用不同的染料来提高透明样本的对比度。

5.2.1.5　暗场显微

对于透射强度和反射强度轻微变化物体的显微成像，在亮场显微中很难获取可以观察的对比度。在倾斜照明情况下，大部分的直射光束没有进入光学系统的入瞳，除了那些样本上的粒子、边沿和其他不规则部位的散射光。从傅立叶光学的观点来看，暗场显微就像是一个高频滤波器，这个滤波器减弱了低频部分。

5.2.1.6　荧光显微

荧光显微是一种生物医疗和材料科学方面极其通用和基础的工具，而且从中发展出许多有用的技术。基本原理很简单：在特定条件下，用高能光子（短波长）激发样本分子，可以引起样本发出低能（长波长或者斯托克斯）光子。荧光显微的能力源于该过程的特殊性：在某些可能的附加条件下（例如：温度、酸碱度、电子场或磁场等），当受到特定波长激发后，分子就会发出特定波长的光子。荧光显微也是一种零背景成像技术，尤其是在落射照明情况下。一些生物分子会辐射荧光（自发荧光），但是大多数情况下的荧光（或荧光染料）是通过绑定或迁移到特定细胞或细胞内部组织添加的，而且可以高效地发出荧光。

绿色荧光蛋白（GFP）和许多其他荧光蛋白的发明已经覆盖了所有的可见光谱段，而且已经对基因科学、生物医学科学、生物医学工程产生了巨大的影响。已经开发了大量的强大技术，其中一些技术具有有趣的缩写。例如FRET，FLIM，FISH，FRAP和FLIP，这些技术利用了影响荧光的各种物理、化学和光学相互作用。