免疫避孕法：理论与潜在途径

12．1 免疫避孕法的基本原理和潜在途径

12．1．1 母体排斥途径

12．1．2 利用动物抗体进行被动免疫途径

12．1．3 生殖道黏膜局部免疫途径

12．1．4 主动免疫途径

12．2 免疫避孕法的潜在优点与不足

12．2．1 免疫避孕法的潜在优点

12．2．2 免疫避孕法的潜在不足

12．3 避孕疫苗的抗原要求与潜在靶抗原

12．3．1 避孕疫苗的抗原要求

12．3．2 潜在靶抗原的类别

12．4 抗精子疫苗

12．4．1 抗精子疫苗的潜在靶抗原

12．4．2 抗精子疫苗的候选特异性抗原

12．4．3 抗精子疫苗的抗生育效率

12．5 抗卵透明带疫苗

12．5．1 卵透明带结构特点及其功能

12．5．2 抗卵透明带抗体的作用机制与卵巢免疫损伤

12．5．3 抗卵透明带疫苗的抗生育效果

12．6 抗人绒毛膜促性腺激素疫苗

12．6．1 HCG的化学结构特点

12．6．2 HCG的免疫原性

12．6．3 抗HCG疫苗免疫避孕的可能机制

12．6．4 以β－HCG为免疫原的疫苗临床试验

12．6．5 以β－HCG－CT 37肽为免疫原的疫苗临床试验

12．6．6 我国HCG避孕疫苗研究

12．7 避孕疫苗的研究趋势

12．7．1 疫苗的抗生育效率是实际应用的关键问题

12．7．2 克服疫苗的个体免疫应答差异

12．7．3 提高抗原的免疫原性

12．7．4 开发自检式简便抗体检测盒

12．7．5 提高疫苗的安全性

12．7．6 有效维持高滴度抗体水平是免疫避孕成功的前提

12．7．7 利用黏膜免疫系统进行免疫避孕已受到重视

12．7．8 生育可逆性是免疫避孕必须考虑的重要问题

免疫避孕（immune contraception）是利用机体自身的免疫防御机制来阻断生殖过程中的某一环节，使正常的生殖生理活动被中止，从而产生抗生育效应。它是处在发展阶段的一类新型生育调节方法，目前尚未有一种免疫避孕的方法可在临床应用。

自20世纪初证实精子具有抗原性并能诱发特异性抗体后，人们通过免疫有意识地诱导出多种动物不育，并在一些不育男、女患者血清中观察到存在免疫因素，这两方面的发现激发科学家研究高等哺乳动物和人类中免疫反应与生殖的关系，进而提出应用免疫学方法控制生育的设想。1920～1934年，至少有过12次在妇女中尝试免疫避孕的报道，其中一些研究表明：①反复给予妇女注射没有加入免疫佐剂的精液或精子，能够产生抗体和造成不育，如1932年Baskin给20位具有生育力的妇女分别注射其丈夫的精子，这些妇女均产生了抗精子抗体；②抗体可维持达9～12个月，在抗体持续期内不受孕；③抗体滴度下降至阴性，妇女可再次怀孕；④受试妇女除不孕外无任何明显的生理紊乱，这些事实揭示了免疫避孕的可能性。1937年美国给以精子为抗原的“精子毒性疫苗”授予了专利。1973年世界卫生组织人类生殖研究发展和培训规划署（WHO，HRP）成立了生育调节疫苗项目组，组织协调进行免疫避孕疫苗的研制，洛克菲勒基金会等国际组织也支持发展免疫避孕。国际上已研制出第一、二代避孕疫苗，并完成了Ⅰ、Ⅱ期临床试验。我国于1986年将避孕疫苗立项科技攻关，经过10年全国多中心协作研究，初步研制成功国产第一代避孕疫苗，并进行了Ⅰ期临床前预试验。国内外的这些成绩以及临床试验暴露出的问题，促使免疫避孕进入了新的发展阶段。

12．1 免疫避孕法的基本原理和潜在途径

免疫避孕法的方法学实质是给健康的育龄男、女性注射生育预防针，即通过接种疫苗抗生育。其基本原理是选择生殖系统或生殖过程的抗原成分构建疫苗，进行人工主动免疫，调动接受者免疫系统，通过抗体或细胞介导，对相应的生殖靶抗原免疫攻击，从而阻断正常生殖生理过程的某一环节，达到避孕的目的。

从理论上而言，应用免疫学原理抗生育有4条途径。

12．1．1 母体排斥途径

调控母体的免疫状态，使母体排斥胎儿。这一途径的抗生育效应阶段偏后，而且母胎相互作用的许多免疫学机制尚不清楚，故此途径尚处于探索阶段。

12．1．2 利用动物抗体进行被动免疫途径

从动物中可以生产出阻断人类生殖过程的高度特异性抗体，而且被动免疫可以随意终止，受免疫者生育力的恢复容易预知。但被动免疫通常只在较短时间内（数周）有效，需要屡屡给药，而反复多次注射动物抗体易发生异种蛋白反应，故此法不便实际应用，安全性差。除非通过免疫球蛋白改造技术制备出针对生殖抗原的危险性小的外源性抗体，被动免疫的应用才可行。

12．1．3 生殖道黏膜局部免疫途径

调动生殖道黏膜的局部免疫机制来抑制配子成熟、迁移，或干扰配子功能，或阻断受精、着床。由于这条途径的疫苗有效作用发生于生殖道管腔，管腔内需有高的抗体水平才能中和抗原负荷，可能产生良好的抗生育效应。此途径的开发近年受到重视，研究工作主要集中在雌性生殖道寻找最佳接种途径和效应位点、构建合适抗原载体，对雄性生殖道的局部免疫功能与抗生育相互关系的研究甚少。

12．1．4 主动免疫途径

利用生殖系统或生殖过程的特异性抗原进行主动免疫，即应用疫苗调控生育，这是人类免疫避孕的一条理想途径。接受者经过一次或数次免疫后能诱发机体产生较长时间的免疫力，其抗生育效应是通过产生抗体或致敏淋巴细胞，或兼有两者来实施的。国外数种避孕疫苗的临床试验和我国第一代避孕疫苗的临床前预试验就是采用此种策略。

12．2 免疫避孕法的潜在优点与不足

12．2．1 免疫避孕法的潜在优点

免疫避孕法的潜在优点为：①生殖系统或生殖过程存在多个潜在靶位（表3－12－1），可选择单个靶位供免疫攻击，也可以构建多价疫苗在多个生殖靶位阻断生殖过程，从而提高抗生育效率和增加生育期人群的可接受性。②疫苗所用抗原为人体自身所有，为非药理性物质。③免疫后抗体维持时间相当长（＞12个月），为长效避孕。一段时期后，若需继续避孕进行强化免疫即可。④一经注射疫苗，免疫反应所引起的避孕效果不易受随意性人为因素的影响，可减少使用者的失败率。⑤抗生育作用具有可逆性，可根据计划解除避孕，恢复生育力。⑥理想的避孕疫苗不会引起内分泌和代谢紊乱，不干扰性活动和性反应。⑦免疫注射无需特殊设备，易于推广。⑧人们以往有疫苗注射的概念，对这种方法易于接受。

表3－12－1 生殖系统可供免疫攻击的潜在靶位

12．2．2 免疫避孕法的潜在不足

（1）免疫反应：与非靶标的交叉抗原发生免疫反应，可诱发自身免疫病，造成相应组织细胞病理性损伤和功能障碍或内分泌紊乱。如精子是男性的自身成分，抗精子疫苗用于男性，存在着诱发睾丸及男性生殖道自身免疫病理损伤的危险。引起这类自身免疫病的可能原因是：①疫苗所用的抗原含有与其他组织共有的抗原表位；②不同组织中类似结构的抗原有共同的空间构型重叠；③T、B细胞的协同使免疫反应从一个抗原表位扩展到另一个抗原表位。

（2）抗原过量：循环血液中若存在自身抗体，容易与游离于细胞外的抗原发生免疫反应，形成免疫复合物，如体内长期积累有可能引起机体某些组织出现免疫性病理变化。

（3）抗体产生及抗原代谢与避孕效果的直接关系：疫苗注射后，抗体产生要经历静止期和指数期，而且不同个体对疫苗反应有很大的强弱差别，故接受者接种后抗体升至抗生育水平需一段时间（数周甚至数月），在此时期仍需借助其他方法避孕。抗体滴度下降期若未能及时监测抗体水平和采取补充避孕措施，则容易怀孕。此时期受孕可能会由于抗体与胎儿物质起交叉反应，导致胎儿损伤和先天性畸形。

（4）不可逆损伤免疫反应可能对生殖系统的某些组织细胞造成不可逆损伤，导致按计划终止避孕时不能恢复生育力。

以上这些潜在危险或不足仅是理论上的推测和假设，但发展免疫避孕法时必须考虑和排除各种不安全因素，防患于未然。

12．3 避孕疫苗的抗原要求与潜在靶抗原

12．3．1 避孕疫苗的抗原要求

免疫避孕是通过注射避孕疫苗来实施，因此该法能否取得成功的前提是疫苗所采用的抗原。选择抗原需满足以下要求。

（1）抗生育效应：必须是参与生殖过程，或是在生殖过程中分泌产生的成分，该成分在结构和功能对某一生殖环节起决定作用。被免疫反应中和、消除或抑制后，导致抗生育效应。

（2）组织特异性：这种成分仅是预定的靶细胞所表达或分泌的，在其他组织中不存在。这样可避免所诱发的抗体或致敏淋巴细胞与非靶标组织发生交叉反应，降低发生代谢紊乱和毒副作用的风险。

（3）高度免疫原性：可诱发有效的特异性免疫反应，但不伴有其他不希望的免疫反应，如产生Ig G引起的变态反应。

（4）安全性和有效性评价：该成分可以种属交叉存在，以便建立合适的实验动物模型，对疫苗进行临床前的安全性和有效性评价。

（5）抗原：化学结构已完全阐明，可以通过经典的化学合成方法或现代分子生物学技术大规模生产抗原，满足制备避孕疫苗的实际需要。

人类生殖是一个复杂的连续过程，从精子、卵子的发生和成熟，精卵相互作用导致受精，发育胚胎着床及妊娠维持等，每个环节都存在或涉及一些结构与功能独特的重要分子，对其分离、纯化可以选择作为研制疫苗的抗原，其中以精子、卵子和着床前胚胎表达的或由它们分泌的分子进行抗原研究最为重视。

12．3．2 潜在靶抗原的类别

接种免疫疫苗，所期待的效应是能够对靶抗原发动免疫攻击，从而中和、灭活靶抗原分子或清除膜表面表达靶抗原的细胞，达到阻断细胞生殖生理活动的目的。生殖系统或生殖过程的一些特异性分子可以作为免疫攻击的潜在靶抗原，按照其分子特性可分为以下两类。

（1）激素：主要是对配子发生、成熟起调节控制作用的激素，以及早期妊娠分泌的激素，如下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（Gn RH）、垂体分泌的黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）、性腺分泌的类固醇激素（如睾酮、雌二醇、孕酮）、胎盘分泌的人绒毛膜促性腺激素（HCG）和人胎盘催乳素。

（2）与配子或胚胎关联的蛋白质：主要是成熟配子和着床前胚胎表达的或存在于它们表面的蛋白质，如精子膜蛋白、精子酶、卵透明带、早孕因子、滋养层细胞非激素抗原等。

动物实验表明，对生殖过程中的一些靶标进行免疫攻击，通过抗体中和激素的生物学效应、抑制酶活性、改变细胞功能、溶细胞作用和细胞毒效应等，可以产生不同程度的抗生育效应。但是，作用于人体需结合安全性、有效性和可接受性来考虑，上述有些分子并非为理想的靶抗原。

12．4 抗精子疫苗

12．4．1 抗精子疫苗的潜在靶抗原

在男性，潜在的靶抗原是成熟精子表达的或存在于它们表面的蛋白质，包括睾丸精子发生形成的精子质膜的固有成分、附睾精子成熟阶段暴露出的膜成分、附睾分泌附着在精子表面的成分、副性腺分泌附着在精子表面的成分，如精子膜蛋白和精子酶等，免疫攻击这些成分应使精子结构完整性丟失或精子功能降低，导致精子授精失败。但是，由于睾丸曲细精管内没有血管，加之血－睾屏障的免疫隔离作用，循环抗体难以接触到睾丸阶段曲细精管内的潜在靶标。睾丸精子迁移入附睾贮存和经历成熟，附睾存在血－附睾屏障，一般情况下循环抗体也难以透入接触到附睾管腔内的成熟精子。因此，虽然理论上可以考虑将晚期精子细胞、睾丸精子和附睾中的成熟精子所表达或表露的特异性蛋白作为潜在靶标，但须避免发生男性自身免疫反应，以及需使曲细精管内或附睾管腔内有适当的抗体水平以应对巨大的抗原负荷，这样才能获得良好的抗精子免疫避孕效果。

在女性，精子在女性生殖道迁移获能，在输卵管发生顶体反应，与卵子接触发生精－卵识别，这些过程精子表面所暴露出的特异性蛋白质可以作为潜在靶标。但是，女性生殖道管腔内所有精子表达的这种抗原分子构成了高的抗原负荷，有效的免疫避孕要求女性生殖道管腔内需有高的抗体水平，这样才能中和抗原负荷，阻断受精前或受精过程中的某个环节。

12．4．2 抗精子疫苗的候选特异性抗原

精子对男性是自身抗原，对女性是同种异体抗原，精子对男、女性都具有很强的免疫原性，精子免疫可导致不育。据临床观察， 70％的男性结扎输精管后产生了抗精子抗体，但没有明显的不良反应；5％～15％的男性或女性不育患者是由于抗精子抗体导致不育，而这些男、女性不育患者的身体是健康的。这些事实提示，人体内存在的抗精子抗体没有对内分泌和代谢等生理活动产生毒副反应，对精子抗原的人工主动免疫有可能调控人类生殖。但是，全精子本身不能作为抗原用于疫苗，因为精子质膜、顶体、核等部位存在着一些与身体很多组织所共有的抗原。因此，仅有那些是精子特有的关键抗原才具有发展为抗精子疫苗的可能性。

相对于抗精子疫苗在男性应用存在诱发自身免疫的高风险，选择特异性精子成分发展女用疫苗受到关注。由于性交进入女性生殖道的精子数以亿计，它们又处于不同的成熟阶段，表达的特异性蛋白质各不相同，而且在生殖道迁移时抗原也有变化，故精子的特异成分复杂且数量众多。发展女用抗精子疫苗，候选特异性抗原包括非膜表面蛋白（如LDH－C4）、与顶体相关的蛋白（如顶体素、PH－20、SP－10、HS－63/MSA－63）、与卵透明带作用相关的蛋白（如FA－1、RSA－1、TCTE1）、与精－卵融合潜在相关的蛋白（如PH－30、CS－1、YWK－II）等。此外，以附睾蛋白酶抑制蛋白Eppin为抗原发展男用抗精子疫苗近年备受关注。

（1）LDH－C4：为乳酸脱氢酶同工酶，仅存在于哺乳动物和人类的睾丸和精子。在性成熟后才能检测出LDH－C4活性。在精子发生过程，LDH－C4出现于初级精母细胞阶段。在成熟精子，LDH－C4主要位于细胞质和中段线粒体内，也有一部分非特异性地吸附在精子膜上，影响精子能量代谢。

LDH－C4具有高度的细胞特异性，与体细胞的LDH同工酶无交叉反应。女性不合成LDH－C4，男性LDH－C4位于血－睾屏障内，与机体免疫系统相隔离，即LDH－C4是一个自身和同种异体的精子特异性抗原，但它的免疫原性弱。研究显示，全精子免疫小鼠没有产生特异性抗体，不育患者也没有检测出抗LDH－C4抗体。采用纯化的小鼠LDH－C4主动免疫、小鼠、大鼠、兔和狒狒，可不同程度地抑制其生育功能。Goldberg等选择合成肽段与白喉类毒素偶联制备成LDH－C4避孕疫苗，主动免疫雌性狒狒，所有被免疫动物都可测出抗LDH－C4抗体，对照组的妊娠率为71％，实验组仅为22％，停止强化免疫后动物可恢复生育力，表明疫苗是有效的和具有可逆性。为了提高免疫原性，采用表达人LDH－C4的重组牛痘苗（活的运载体）免疫狒狒，结果发现其生育力显著降低，停止应用后生育力恢复正常。但是，有报道应用LDH－C4主动免疫雄性小鼠， 43．3％的免疫雄鼠出现睾丸炎，制约了LDH－C4发展为男用避孕疫苗。

抗LDH－C4抗体在体外引起的小鼠、兔、狒狒和人的精子凝集，加入补体后精子被制动。主动免疫兔的宫颈黏液、子宫液和输卵管液中均可检出特异性抗体，观察到精子在输卵管内转运明显受抑制，提示LDH－C4抑制生育的机制是抗LDH－C4循环抗体从雌性生殖道渗出，在宫颈、子宫、输卵管等部位与精子结合，制约精子在生殖道中迁移和行使功能，进而阻止受精。有资料表明，被免疫动物的胚胎存活率显著降低，提示LDH－C4抗生育作用的另一机制可能涉及着床后胚胎死亡。但是，胚胎组织未发现LDH－C4的存在，免疫后如何导致胚胎发育中止尚不清楚。

（2）PH－20：是相对分子质量为64 000的内膜蛋白质，位于豚鼠精子头部浆膜上，顶体反应后出现在顶体内膜，表现有透明质酸酶活性。它与雌性豚鼠其他组织无交叉反应，是精子特异性抗原。Primakoff等用纯化的PH－20主动免疫雌、雄性豚鼠，引起100％的不育，而且免疫雄鼠没有出现睾丸炎。终止免疫后，两性豚鼠均可恢复生育力，表明避孕效果是可逆的。抗PH－20抗体在体外可抑制精子与卵透明带结合。用重组兔PH－20（rPH20）皮下免疫家兔，血浆中有高滴度抗r PH20抗体，但进入雄、雌性生殖道的抗体很少，抗rPH20抗体在睾丸、附睾、阴道、子宫、输卵管内的浓度均不足血浆水平的0．2％。人PH－20与豚鼠PH－20在cDNA水平有59％同源性，但豚鼠PH－20单克隆抗体并不结合在人精子上，免疫不育患者血清也没有检测出对PH－20特异的抗体。因此，PH－20作为抗精子疫苗的靶抗原尚待研究。

（3）SP－10：是由单克隆抗体鉴定的一组人精子蛋白，相对分子质量为10 000～34 000，在生精过程中产生，是一个分化抗原。它位于顶体内膜上，可能是结合在顶体内膜和顶体基质表面的蛋白质。在受精过程，精子要经历顶体反应。顶体反应后，顶体内膜裸露，女性生殖道的抗体就可接触到顶体内膜上的抗原，相互结合后影响精子穿透卵透明带，进而阻止受精，故SP－10是有希望的靶抗原。SP－10的单克隆抗体与体细胞没有或很少有交叉反应。用人重组SP－10主动免疫雌性狒狒获得的抗体，能参与这种分化抗原反应。几种实验动物免疫后产生了高滴度抗体，但只有一部分降低生育功能。因此，免疫不育患者血清中是否存在SP－10的抗体尚未确定。

（4）FA－1：是从啮齿动物和人精子膜中通过单克隆抗体分离提纯的糖蛋白，由相对分子质量为51 000±2 000的二聚体和（或）相对分子质量为23 000的单体组成，位于精子顶体后区、中段和尾部。FA－1是一个进化保守抗原，抗FA－1抗体与小鼠、兔、牛、猴和人精子表面上的抗原有交叉反应。人与这几种动物精子FA－1的分子非常相似，功能也相近。动物和人的体外受精实验表明，抗FA－1的单克隆抗体完全阻断了受精。采用纯化的FA－1主动免疫兔，发现几乎完全阻断了其生育力。Naz等合成了含FA－1抗原有效决定簇的10肽，与不育患者的血清起强反应，但与生育正常者的血清无反应。抗此10肽的抗体抑制人精子穿透去透明带仓鼠卵。牛精子有与FA－1相似的抗原基因，以牛做模型，应用合成10肽进行主动免疫试验显示受孕率降低。

Naz等证实FA－1抗体能与猪卵透明带分离纯化的糖蛋白ZP3结合，进一步发现抗体抑制人精子结合于人卵透明带，提示抗FA－1抗体的抗生育机制是影响精子与卵透明带的相互作用而阻止受精。另一方面，抗体的存在使精子丢失进入去透明带仓鼠卵的能力。由于去透明带仓鼠卵穿透实验可以通过穿卵率间接反映人精子的获能状态，穿透卵子受抑制表明精子获能受阻，这是抗体直接作用于精子表面涉及获能成分的结果。Kaplan等证实抗体抑制人精子顶体反应，提示FA－1抗原可能是一个精子受体结合蛋白，而且对精子获能和顶体反应发挥作用。

在免疫不孕妇女血清和宫颈黏液中检测到抗FA－1抗体，输精管结扎者和不育男性也存在特异性抗体，表明FA－1抗原对自身和同种异体均有致免疫性，诱发的抗体涉及不育。大多数抗FA－1抗体阳性不育患者是健康的，除不育外没有伴发其他疾病，间接提示FA－1是精子的特异性。

（5）CS－1：卵子在受精后开始卵裂，但受精卵接受什么信号启动卵裂尚不清楚。人胚胎在4～8细胞期开始转录，因此发出第一次卵裂的信号应该是卵核外的信息或分子，由精子带入卵的物质有可能提供某种诱导卵裂的信息作用。如果阐明这种成分，调动免疫系统攻击之，可中止卵裂达到避孕目的。

CS－1由相对分子质量为14 000和18 000的双链组成，为精子表面抗原。实验证实其是一个卵裂信号蛋白，可以给出卵裂的最初信号。CS－1存在于人精子表面。在免疫不孕妇女血清中检测出抗CS－1抗体。如果抗CS－1抗体存在，抗体通过抑制原核期卵子的第一次卵裂来阻断生育，这是CS－1抗生育的可能机制。从人睾丸分离的CS－1蛋白已经克隆并测定氨基酸顺序，未见与已知顺序有任何同源性。

（6）Eppin：是一种睾丸和附睾特异性分泌蛋白，单体相对分子质量16 000～18 000，分为两个亚型。Eppin基因含 Kunitz和WAP型双重基因结构，具有丝氨酸蛋白激酶抑制剂样结构特点。人精子表面有大量Eppin受体，睾丸和附睾分泌的Eppin结合在精子的头部和尾部。Eppin蛋白参与调节精液液化和精子运动，体外实验表明抗Eppin抗体会干扰前列腺特异性抗原对精囊凝固蛋白的水解，导致精液凝固异常，影响精子前向运动。将人精子与抗Eppin抗体共孵育，抗Eppin抗体能显著抑制钙离子载体A23817诱导的顶体反应，这种抑制作用呈剂量依赖关系。O'Rand等用重组Eppin免疫成年雄猴，精液和血清中出现高滴度抗Eppin抗体，精子前向运动能力降低，精液黏稠度下降，78％雄猴发生不育。通过每3周1次的强化免疫，可以维持抗Eppin抗体的高滴度达691天。停止接种后，71％雄猴可恢复生育功能，未观察到不良反应。小鼠的Eppin与兔、猴、人分别有51％、60％、62％的同源性。Eppin作为男用抗精子疫苗的靶抗原值得深入研究。

12．4．3 抗精子疫苗的抗生育效率

抗精子疫苗的抗生育效率，除个别报道外，迄今还没有动物实验结果显示一个单独的精子抗原能导致免疫动物受孕率100％下降，很可能单个精子抗原构建的疫苗不能产生足够高的抗体水平，以完全阻断受精。一方面，检验抗精子疫苗的抗生育效率常用小鼠模型，但是大部分实验显示精子抗原只导致约75％的小鼠生育力下降，提示小鼠的遗传属性可能不是评估疫苗抗生育效率的最佳模型。另一方面，由于小鼠每个周期排卵20～50个，而妇女每个周期仅排卵1个，是否小鼠的75％生育力降低即等同于妇女的100％生育力降低，尚待研究。(www.xing528.com)

抗精子疫苗应用于妇女免疫避孕，疫苗的有效作用部位若为女性生殖道管腔，如抗体介导阻止精－卵识别，或抑制精子顶体反应，则需要输卵管峡部、壶腹部节段管腔内达到较高的抗体水平，才可能产生良好的抗生育效应。常用的免疫注射接种，主要诱导循环抗体的产生，可以作用于经血液循环转运的靶抗原分子，但生殖道管腔内部对循环抗体没有高效的转运途径。用精子抗原仅作为阴道免疫或宫腔免疫似乎无抗生育效果，小鼠子宫内注射精子生育力也未发现变化。妇女采用经洗涤、浓缩的精子做多次宫腔内授精也没有发现抗精子抗体的产生。因此，寻找女性生殖道中对抗原吸收和免疫反应的特异性诱导位点，设法采用精子特异性抗原诱导生殖道局部黏膜分泌性免疫反应为研究方向，局部黏膜免疫与全身免疫相结合，才能维持和保证生殖道内的高抗体滴度，对进入生殖道内的精子做有效的综合性免疫攻击。

12．5 抗卵透明带疫苗

卵透明带（zona pellucida，ZP）是围绕在哺乳动物卵子和着床前胚胎外周的一层透明的细胞外糖蛋白基质，在受精早期阶段的精－卵识别，精子黏附、结合及穿透卵子过程有重要的生理作用，而且还阻止多精入卵，为着床前发育的胚胎提供机械性保护作用。

卵透明带具有高度的免疫原性，应用卵透明带为抗原发展免疫避孕疫苗具有以下潜在的优点：①卵透明带仅定位在卵子上，以一个细胞作为靶标容易受到免疫攻击；②成年女性每个月只排出1个卵子，卵透明带靶抗原量少，免疫攻击具有高效力；③排卵后卵透明带伴随卵子在女性生殖道内存在数天，抗体有充分时间与靶抗原结合，并中和靶抗原的生物活性；④卵透明带是精子授精必须穿过的结构，阻断此环节则抑制受精；⑤疫苗的抗生育效应发生在受精前，这是较理想的避孕环节，亦避免了流产引起伦理学和宗教等方面的异议，有较广泛的社会接受性。

12．5．1 卵透明带结构特点及其功能

卵透明带是非细胞结构，人卵透明带厚度约为20μm。应用扫描电镜观察，卵透明带表面呈不均一性、相互交织的纤维丝网结构，免疫球蛋白、酶和病毒可以透过。透射电镜观察卵透明带由纤维和糊精状物质组成，电子密度显示出内外两层，经抗卵透明带抗血清处理后，电子致密斑分布可发生变化。

人卵透明带由3种酸性糖蛋白组成，按相对分子质量命名为ZP1（90 000～110 000）、ZP2 （64 000～74 000）和ZP3（57 000～73 000）。在卵透明带中3种糖蛋白都是以二硫键连接的肽链二聚体，并含有N－和O－键的寡糖。3种糖蛋白各自有其特异的功能，ZP3是主要的精子受精蛋白，以O－糖苷键与肽链相连的寡糖侧链是受体所在点。对精子在卵透明带上黏附起作用。它不但能够分辨出具有完整无损顶体和发生顶体反应的精子，而且还能分辨出精子的不同区域。从卵子制备出的纯ZP3特异性地与顶体完整的精子头部结合，每个精子头部能结合10 000～50 000个ZP3分子。随着与ZP3受体蛋白结合，精子诱发顶体反应。ZP1和ZP2不能诱发顶体反应，从已受精的卵子或胚胎卵透明带所制备的ZP3也无诱发能力。ZP2是精子次级受体，对精子在卵透明带上的结合阶段起辅助作用。精卵融合后，ZP2和ZP3一起发生生化修饰，引起ZP3溶解性和空间立体结构改变，从而阻止多精受精。ZP2和ZP3二聚体串成纤维丝状珠链，ZP1则是将珠链相互交联形成网状的蛋白质高级结构。

12．5．2 抗卵透明带抗体的作用机制与卵巢免疫损伤

抗卵透明带抗体在猪、兔、狗、猴等多种动物模型的主动免疫中显示出良好的抗生育效果。临床上一些原因不明的不孕妇女血清中含有抗卵透明带抗体，其不孕与抗体存在有关。在人类体外受精试验，用检测出抗卵透明带抗体的妇女血清，加入正常的精－卵共孵育，结果抑制了受精。从抗卵透明带抗体阳性妇女中取出卵子，做体外受精也未能获得成功。

抗卵透明带抗体抑制受精的机制是通过以下其中一项进行的：①抗卵透明带抗体与卵透明带上的精子受体位点反应，或与靠近这位点的抗原部位结合，直接阻断精－卵相互作用；②抗体引起立体空间结构障碍，遮蔽了卵透明带上的精子受体来阻止精－卵结合。抗卵透明带抗体能够100％阻止受精。

但是，抗卵透明带抗体对卵巢也存在一些与精－卵结合无关的效应。在卵透明带免疫避孕研究的早期就观察到，实验动物免疫后出现卵巢功能障碍。与睾丸不同，卵巢中没有免疫学隔离机制，卵巢中各种细胞类型及其发育分化过程全部暴露于抗体和其他血清成分，卵透明带从发生到形成与卵巢关系密切，免疫攻击卵透明带的同时容易影响卵巢的功能。体内试验表明，当主动免疫引起的抗体滴度达到有效抗生育水平时，被免疫的雌性动物往往伴有月经不规则和生殖激素紊乱。对这些动物卵巢的组织学检查发现正常卵泡生长过程受到干扰，典型的表现是原始卵泡、初级卵泡和发育卵泡完全缺失或显著减少。其原因可能是抗体造成了自身免疫性疾病，或者是注射的抗卵透明带疫苗与颗粒细胞和（或）卵细胞分泌的卵透明带蛋白发生反应，使得囊状卵泡不能分泌合成类固醇激素，以及造成生殖细胞和卵泡细胞衰竭。因此，动物体内试验提示抗卵透明带抗体是在两个水平上发挥抗生育作用：①在卵透明带水平，阻断与精－卵相互作用；②在卵巢水平，阻断正常的卵泡发生、发育过程。但是，后一水平可导致严重的卵巢损伤，这在育龄期妇女作为免疫避孕是不能接受的。

12．5．3 抗卵透明带疫苗的抗生育效果

长期以来，由于人卵透明带来源匮乏和伦理学制约，难以应用人卵透明带为抗原发展抗卵透明带疫苗。卵透明带抗原并非高度种属特异。几个种属的动物之间存在种间交叉抗原，这种免疫学的交叉反应为应用异种动物卵透明带制备避孕疫苗，解决抗原来源提供了基础。

早期研究用猪卵透明带进行异种主动免疫雌性家兔、狗、马和猴，生育力显著丢失。猪卵透明带与人卵透明带有部分共同抗原性，抗猪卵透明带抗体能够阻止人卵体外受精。但是，近年对猪ZP1、ZP3α、ZP3β的抗原B细胞表位鉴定显示它们的抗原表位在人卵透明带上不存在，提示猪卵透明带不适合用作人抗卵透明带疫苗的抗原。另一方面，以猪卵透明带为抗原构建的避孕疫苗在控制野生动物种群的过度繁殖中取得显著成效，至今已有逾百种哺乳动物，如野马、白尾鹿、非洲象等尝试使用抗卵透明带疫苗，避孕效果高达90％，而且动物不育期长达5年。对野生动物免疫避孕而言，不育或绝育都是希望达到的抗生育效果，故卵透明带免疫导致的动物卵巢功能障碍是可以接受的。

为克服卵透明带免疫后出现卵巢功能障碍，将卵透明带上的T细胞与B细胞抗原表位分离，去除卵透明带上刺激T细胞的抗原表位，用仅含刺激B细胞的抗原表位制备疫苗。Millar等用已知可阻断受精的小鼠ZP3单克隆抗体为探针，鉴别出含7个氨基酸的刺激B细胞的抗原表位。采用基因工程合成含此抗原表位的16个氨基酸肽段，并通过N－末端半胱氨酸残基与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联，使用福氏佐剂，主动免疫小鼠均产生抗体，观察到抗生育作用直接与抗体滴度相关，避孕作用可长达16～36周，抗体滴度水平不高的动物可恢复生育功能，而卵巢切片未见炎症迹象和细胞毒性作用，提示不含T细胞抗原表位的合成ZP3肽段产生的循环抗体是卵透明带特异性的，不与其他卵巢抗原发生交叉反应，并不诱发细胞毒T细胞对卵透明带的免疫反应和造成卵巢组织病变。进一步的研究表明，T细胞对卵透明带的作用无需B细胞协同就可导致卵巢炎，而抗卵透明带抗体可能仅引起可逆性不育。因此，在鉴定卵透明带蛋白中更多的B细胞抗原表位的基础上，以卵透明带蛋白的B细胞抗原表位为靶标，采用化学合成肽或嵌合肽构建疫苗，有可能提高疫苗的安全性。报道显示几种合成肽或嵌合肽疫苗应用后，抗体可阻断体外人精－卵的结合，实验动物未观察到自身免疫性卵巢炎（表3－12－2）。

表3－12－2 几种卵透明带蛋白免疫避孕疫苗的效果

注：ZP示卵透明带；aa示氨基酸残基。

12．6 抗人绒毛膜促性腺激素疫苗

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是受孕后由胎盘合体滋养层细胞分泌的妊娠特异性激素，主要功能是通过刺激黄体持续合成孕酮，以维持早期妊娠，并可能起到防止母体排斥胚胎及其产物的作用。选择HCG作为免疫攻击的靶标，除满足靶抗原的一般要求外，还具有以下特点。

1）正常情况下循环血液中不存在HCG，它仅在怀孕时才暂时出现，不干扰排卵和性激素合成等生理过程，机体的其他组织和其他生理活动中也无类似的抗原存在，即靶标特异和作用时间局限。

2）受精后的第4～5天，HCG在囊胚期的滋养层即可出现，此时干扰HCG作用终止妊娠，抗生育效应阶段不算偏后，妇女仅表现为正常或稍延长的月经周期，对身体没有产生明显不适的影响和损害，容易接受。

3）维持妊娠所必需，阻断此环节容易达到100％的抗生育效果。

4）HCG的化学结构、理化性质和生物活性基团已基本清楚，有利于分析和应用。

5）抗原需量相对于配子抗原容易解决， HCG以前从孕妇尿中提取获得，现在可通过分子生物学技术大量制备。

12．6．1 HCG的化学结构特点

HCG是相对分子质量约38 000的糖蛋白激素，由α、β亚基组成。α亚基含有89～92个氨基酸，与垂体分泌的糖蛋白激素LH、FSH和促甲状腺素（TSH）的结构非常相似，但它的β－半乳糖和唾液酸含量高。β亚基则与FSH和TSH差别较大，与LH相似程度高。人LH（h LH）的β亚基含有115个氨基酸，HCG的β亚基含有145个氨基酸，两者前110个氨基酸中有94个相同，占85％，除了111和115位的氨基酸残基以外，β－HCG C末端的35个氨基酸序列在β－h LH上不存在，第38～57位肽段呈环状结构，这是HCG与h LH的结构差别所在。

12．6．2 HCG的免疫原性

完整的 HCG对人本身未表现出抗原性，给妇女注射HCG治疗不育并未引起对此激素的免疫反应，一般情况下检测不出抗HCG抗体，这是因为HCG是人体自身所分泌合成的分子，免疫系统能识别其是自身的，对其免疫耐受而不引起免疫反应。而且， HCG的α亚基与人LH、FSH和TSH的α亚基在很大程度上相似，用完整HCG分子免疫所产生的抗体会与这几种激素发生交叉反应，导致严重的内分泌和代谢紊乱。

HCG的β亚基与LH、FSH和TSH等垂体糖蛋白激素有不同程度的差异，即在结构上是激素特异，故有一定的免疫特异性。研究者利用β亚基的这一特点，以化学改性或蛋白质工程，将全β亚基（β－HCG）或其C末端特异肽段（β－HCG－CTP）适当结构改造制备避孕疫苗，使之既不失去原有的HCG生物活性，又能使机体免疫系统识别不出是“自身抗原”，而视为非自身异种蛋白抗原，引起相应的免疫反应。

12．6．3 抗HCG疫苗免疫避孕的可能机制

卵子受精后，准备着床的囊胚滋养细胞很快分泌HCG，人胚胎在第8细胞期已可检测出β－HCG mRNA。如果妇女接种了抗HCG疫苗，推测疫苗的抗生育起效时间应在此后很快出现。主动免疫狒狒和狨猴所取得的数据表明，抗HCG疫苗阻断生育功能确实发生在妊娠的早期阶段，以致未观察到动物的月经周期改变。抗HCG疫苗的抗生育效应可能涉及体液免疫和细胞免疫。疫苗刺激产生抗体，循环抗体通过改变HCG生物活性中心的分子构型或立体空间结构，阻碍激素－受体相互识别，中和了HCG的促黄体效应，导致黄体功能难以维持，围着床期的胚胎被排出，妊娠中止。另一种可能机制是直接针对围着床期胚胎HCG产生细胞的抗体介导或细胞介导的细胞毒效应，损伤HCG产生细胞（滋养层细胞）引起HCG分泌下降，结果黄体退化，妊娠中止。Hearn等将狨猴胚胎与抗HCG抗体共孵育后，胚胎没有着床，提示如果在输卵管腔和子宫内存在充足的抗体水平，抗HCG疫苗在胚胎着床前已发挥效应。

12．6．4 以β－HCG为免疫原的疫苗临床试验

发展抗HCG避孕疫苗有两条不同的技术途径，以HCG的全β亚基为免疫原和以C末端109～145的37肽段为免疫原。这两类免疫原经过抗原改造制成的疫苗，通过临床前的毒性与安全性试验，而且都进行了Ⅰ期临床试验以检验疫苗在人体的安全性和在人体中诱发抗体的能力，以及Ⅱ期临床试验以检验疫苗在人体的抗生育力和进一步观察疫苗的安全性。

印度Talwar（1979年）将纯化的β－HCG偶联到大分子载体破伤风类毒素（TT）上制备成原型疫苗（Pr－β－HCG－TT），在印度、瑞士、巴西、芬兰和智利5国的6个中心进行了Ⅰ期临床试验，在主动免疫的60例输卵管结扎妇女中，大部分显示抗体与h LH有一些交叉反应，但仍有规则的月经和正常排卵，有些受试者随访7年以上，肝、肾、甲状腺、肾上腺、垂体和造血功能等参数均在正常值范围。另一方面，原型疫苗在Ⅰ期临床试验中暴露出免疫反应有很大的个体差异。仅28％的受试者有高抗体滴度，而72％的受试者抗体反应一般或较差，个别妇女甚至不产生抗体。抗体水平低无抗生育作用，故受试者避孕失败率高，其中1例受试妇女在研究期间怀孕至分娩，产出一正常男婴，其后的生长、发育均属正常，这一结果提示妊娠时自身产生的内源性HCG并无抗体反应的强化作用，而且疫苗对未能阻止妊娠的胚胎发育具有安全性。免疫妇女万一在抗体消退期受孕，胚胎也是安全的。

疫苗免疫原性弱和个体免疫应答差的缺点，促使研究者对原型疫苗做了3个方面的改进：①将β－HCG通过非共价键与羊LHα亚基（α－oLH）连接，形成异种二聚体（heterospecies dimer，HSD），再偶联TT制成疫苗。HSD所形成的构型能够被靶组织上的受体识别，这种疫苗在羊、猴的免疫实验证明比β－HCG有更强的免疫原性和更好的中和HCG生物活性，而且产生的抗体不与FSH和TSH发生交叉反应。②增加脂多糖邻苯二甲酰钠（SPLPS）作为免疫刺激剂，在疫苗初次注射时同时注入。这种佐剂适用于抗体产生的静止期，它比单独应用Al（OH）3作为佐剂的抗体滴度高2倍以上。③β－HCG－TT再连接多一种载体霍乱毒素B （CHB），以提高免疫诱发抗体反应的能力，减少个体差异。

改进配方后的3种疫苗：①β－HCG/α－oLH－TT－CHB；②β－HCG－TT；③β－HCG－TT－CHB和α－oLH－TT－CHB的混合物。1988年在印度的5个中心进行了Ⅰ期临床试验。受试者为101例有生育史的输卵管结扎妇女，免疫后所有妇女均产生抗HCG抗体和抗TT抗体，抗体反应为可逆性。第1～2种配方疫苗的免疫原性好，抗体结合HCG能力＞20ng/ml的持续时间分别是35～37周和34周，抗体与HCG亲和力较高［Ka＝（1～10）×109/mol］。卵巢充血试验表明，抗体在体内能中和HCG生物活性。抗体不与人FSH和TSH发生交叉反应，但与h LH有交叉反应。受试者月经周期无改变，血浆孕酮浓度提示有正常排卵。血液学、内分泌学和其他代谢参数无异常变化。在免疫前和强化免疫后整个周期内监测和比较尿液促性腺激素排泄的动态变化，提示垂体性腺轴未受干扰和损害。但试验中有11例妇女在强化注射时发生超敏反应和免疫抑制。

TT偶联于疫苗可以打破妇女对HCG的免疫耐受，提高疫苗的免疫原性，与此同时也产生免疫预防性的抗破伤风抗体。但TT在强化注射时引起超敏反应，故Ⅱ期临床试验对此进行了改进，如β－HCG/α－o LH （HSD）分别偶联TT或白喉类毒素（DT），初次注射与强化注射交替应用。同一种载体不重复注入可避免引起超敏反应。HSD－TT或HSD－DT的Ⅱ期临床试验于1992年在印度进行，以检验疫苗的实际避孕有效性。148例23～35岁可生育妇女接受了3次疫苗注射，所有免疫妇女都产生了抗体，其中119例（80％）的抗体水平＞50ng/ml（HCG生物活性中和能力）。受试妇女有正常的性生活，经过1 224个月经周期，仅有1例抗体滴度＞50ng/ml妇女发生妊娠（之后做人工流产）。抗体滴度降至＜35ng/ml可恢复生育力，并已有5个正常婴儿娩出。抗体与hLH交叉反应为10％～75％，但未见月经周期显著改变和其他不良反应。虽然抗β－HCG抗体存在与h LH的交叉反应，但这种反应对生殖内分泌和身体其他系统不产生有害的影响。可能的解释是：①LH是一种分泌性产物，它并不保持在垂体促性腺细胞膜表面，抗体没有进入细胞内与其发生反应，故分泌合成LH过程没有受到影响，使得月经周期和排卵未发生改变；②在每月一次LH峰期所产生的LH量，除去抗体与循环hLH部分交叉反应的消耗量后，还有足够的余量诱导排卵，故不表现出排卵抑制；③抗体在体内与hLH的亲和力很低；④抗体尽管与hLH交叉反应，但没有中和h LH的生物活性。

HSD疫苗是世界上第一个妇女免疫避孕的试验疫苗，所取得的结果令人鼓舞，但不足之处是仍有20％的妇女免疫后抗体滴度未超过抗生育阈值水平。Purswani和Talwar（2011年）新构建的β－HCG－LTB重组疫苗，加入非致病性分枝杆菌（MIP）作为免疫调节剂，给小鼠免疫接种时，同时注射MIP，有效提高了免疫小鼠的抗体滴度。在观察的8个月内，所有小鼠的抗体水平都超过抗生育阈值的3倍至数十倍，而未注射MIP的对照小鼠，高抗体滴度未能维持30天。由于免疫的5个品系小鼠都产生了持续的高抗体水平，一方面显示了MIP的增强免疫反应效能；另一方面也提示能有效克服抗体应答的个体差异。

12．6．5 以β－HCG－CT37肽为免疫原的疫苗临床试验

WHO自20世纪70年代中期开始支持发展避孕疫苗，采用β－HCG C末端特异肽段研制疫苗的技术途径，以109～145肽为疫苗的免疫原。为提高免疫原性，偶合大分子蛋白DT为载体，DT与该肽段结合引起延迟型过敏反应较TT少。

β－HCG－CT 37肽－DT疫苗的Ⅰ期临床试验于1988年在澳大利亚进行。疫苗由化学合成的β－HCG C末端37肽（109～145肽）偶联DT，加免疫刺激剂胞壁酰二肽（MDP）为佐剂，用生物可降解的鲨烯和Arlacel（二缩甘露醇单油酸酯）乳化。30例26～43岁输卵管结扎妇女，每组6例，分为5个剂量组（分别为50、100、200、500及1 000μg免疫原）进行初次和强化免疫。受试者均产生抗HCG抗体，对疫苗的反应呈剂量依赖性。据推算，如果疫苗仅是通过中和HCG生物效应而发挥避孕作用，抗HCG抗血清浓度至少为0．52nmol/L才能中和着床期母体循环血液中的HCG水平。所有5个剂量组的抗体滴度都超过此值的3倍（1～3．5nmol/L或40～140ng/ml），最高剂量组为5～7倍，抗体维持期为6个月，其中2例随访至9～10个月还可检测出抗体滴度仍在抗生育水平。广泛的临床、实验室检查和6个月的随访未见任何与免疫有关的不良反应，月经周期无明显影响，抗体与人FSH和hLH无交叉反应。

β－HCG－CT 37肽－DT疫苗是世界上第一个人工合成用于人体试验的短肽疫苗。Ⅰ期临床试验显示出它具有良好的安全性和免疫原性，也具有潜在的抗生育作用。但是，存在问题是诱发的抗体与HCG的亲和力（Ka约1×108/mol）较β－HCG和HSD （Ka约1×1010/mol）低，个别受试者对DT有超敏反应。WHO对该型疫苗改良后，于1994年初在瑞典进行Ⅱ期临床试验，以检验疫苗的避孕效果，但试验开始后即中止，其原因是首批接受疫苗注射的7例妇女中，有几例注射部位出现组织反应，以及未预料到和难以接受的疼痛。

为能诱发充分中和HCG效应的抗体水平，且避免注射部位产生难以接受的局部反应，WHO研制出含有2个HCG肽段的高级型疫苗，其组成和配方为：β－HCG－CT 37肽（109～145肽）和β－HCG的环状肽段（38～57肽）各500μg，偶联于DT，MDP 25μg为免疫刺激剂，生理盐水（p H值为7．4）作为溶剂，用鲨烯和二缩甘露醇单油酸酯（4∶1）乳化，水相与油相比为40∶60。该高级型疫苗于1998年在英国用兔进行了抗体诱发实验和临床前毒理学研究，结果显示疫苗免疫不会诱发对HCG多肽的免疫抑制反应；通过多次强化免疫可以使有效免疫保护的抗体水平维持6个月，甚至更长时间。不足的是，个别实验兔的注射部位有较严重的肌肉反应，或显示慢性炎症反应。WHO研制改进的抗HCG疫苗，这种疫苗采用完全合成的免疫原，不再偶联DT，并改进疫苗的缓释系统，使一次注射即可产生所需的有效抗体水平和持续时间。

12．6．6 我国HCG避孕疫苗研究

我国在20世纪80年代初期已开始进行避孕疫苗抗原制备的探索性试验。“七·五”期间，国家组织多中心协作组对HCG避孕疫苗科技攻关，从基因工程、生物化学、化学合成等多条途径制备疫苗的免疫原，并完成了β－HCG二聚体、酶切β－HCG肽段和β－HCG－CT 37肽（109～145肽）－TT 3种疫苗的构建。临床前猕猴的免疫原性、安全性和毒理学试验证明，3种疫苗均可诱发动物体内不同程度的抗体产生，抗体不但能与HCG结合，而且可中和HCG的生物活性。免疫动物未见任何毒副反应。持续2年的跟踪观察及对动物解剖检查，未发现任何与疫苗免疫有关的组织损伤。

在此基础上，“八·五”期间制备出以β－HCG为抗原，偶联TT为载体蛋白的我国第一代HCG避孕疫苗，参照WHO人类生殖特别规划委员会发展避孕疫苗制订的Ⅰ期临床试验方案，两位主要研究者（笔者是其中之一）和筛选的10例输卵管结扎妇女志愿者接受了疫苗注射，在严密监护下进行了国产第一代避孕疫苗Ⅰ期临床前预试验，结果证明疫苗在人体有诱发抗HCG的能力，强化注射后有记忆反应，抗体反应随时间推移可消退和有可逆性。受试妇女的一般体检项目及月经周期无变化，血液常规参数、肝和肾功能、心功能等血液生化指标无变化，B超显示子宫、附件正常。LH、FSH、孕激素、雌二醇、甲状腺激素等无异常，无任何疫苗的不良影响。不足的是，疫苗的免疫原性弱，不同个体间的抗体反应有明显的差别。这些结果为我国进一步发展HCG避孕疫苗提供了基础。

12．7 避孕疫苗的研究趋势

12．7．1 疫苗的抗生育效率是实际应用的关键问题

若将多个有特异性的生殖关键抗原合并使用，构建人工合成的、多特异性的复合抗原，研制出多价疫苗，诱发免疫系统产生多种抗体，从受精前、受精、着床前等多个生殖靶位阻断生殖过程，无疑可提高抗生育效率和增加可接受性。

12．7．2 克服疫苗的个体免疫应答差异

国际避孕疫苗的Ⅰ～Ⅱ期临床试验，以及我国的Ⅰ期临床前预试验，均发现受试者之间的抗体反应有明显差别，其中少数妇女即使多次强化免疫后的抗体水平仍较低，即每个机体对疫苗的反应有较大的个体差异。诱发的免疫反应强弱与避孕效果密切相关，只有克服了避孕疫苗的个体免疫应答差异及遗传限制，避孕疫苗才具有广泛的应用价值。

12．7．3 提高抗原的免疫原性

避孕疫苗所使用的抗原为人体自身成分，而且抗原分子不大，故其免疫原性弱，须与免疫佐剂合用才能提高抗原的免疫原性。曾进行临床试验的抗HCG疫苗，使用的载体为MDP、DT、TT等，但大分子载体蛋白的引入易出现载体介导的表位抑制效应及过敏反应，后者是WHO中止β－HCG－CTP疫苗Ⅱ期临床试验的原因之一。无需载体蛋白，又可提高免疫原性的途径是当前重点研究方向。随着生殖道黏膜免疫、基因免疫等免疫避孕途径的深入研究，需重视分子佐剂。分子佐剂与抗原分子交联后能显著提高抗原的免疫原性，在分子水平发挥免疫增强作用。

12．7．4 开发自检式简便抗体检测盒

疫苗免疫后，即使是抗体反应较好的妇女，其免疫注射后至抗体达到抗生育阈值水平尚需一段时间，而且抗体维持一定时间后仍会下降，这就需要对机体的实际抗体水平进行监测。监测机体抗体水平目前靠定期抽血检验，但频繁的定期抽血不利于实际应用，有必要开发相应的自检式简便抗体检测盒。

12．7．5 提高疫苗的安全性

开展对抗原T和B细胞表位的鉴定，尤其重视阐明产生毒副作用的T细胞表位。在疫苗的设计和构建上，通过合成多个B细胞表位，拼接在主体或载体蛋白上，构建空间立体表位以提高分子的免疫原性，同时避免有害T细胞表位导致的免疫损伤，提高疫苗的安全性。

12．7．6 有效维持高滴度抗体水平是免疫避孕成功的前提

靠定期注射疫苗延长抗体维持期的方法不便于实际应用。采用聚乳酸、聚乙酸等生物制剂可共存和可降解化合物研制成微球缓释系统，将疫苗包埋其中，均匀缓慢地释放，不但减少了注射次数，而且可维持较长时间的免疫力，这是应予重视的实际问题。

12．7．7 利用黏膜免疫系统进行免疫避孕已受到重视

有效的抗生育作用需要生殖道管腔内有足够的抗体存在，设法构建特异性抗原和表达体系，选择疫苗接种途径和位点，调动局部免疫机制产生足量高效的特异性抗体，以及如何维持生殖道管腔内的有效抗体水平，尚需加强研究。

12．7．8 生育可逆性是免疫避孕必须考虑的重要问题

去除抗原释放系统，抗体滴度应降低和恢复生育力。如果精子抗原应用于妇女避孕疫苗，性交可能会引起不断强化的效应，不育期会延长，如何去除循环抗体的机制应进一步研究。

随着各种蛋白质组学、基因组学、生物信息学、基因敲除小鼠模型等技术的建立与应用，越来越多的特异性抗原会被鉴定出来，并在动物实验中显示出良好的避孕效果，也会寻找出一些针对生殖环节发挥重要作用的靶标分子，多种类型的疫苗将被构建。但是，要研制出安全、有效、可逆、可供临床实际应用的避孕疫苗还需要做大量的研究工作。

（朱伟杰）

参考文献

［1］陈小佳，李丽玲，朱伟杰，等．非全长型人卵透明带－3蛋白慢病毒表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中表达的研究．生殖与避孕，2007，27（3）：161～165

［2］陈小佳，谢秋玲，朱伟杰，等．非融合膜外型猪卵透明带－3β蛋白在原核系统中的表达研究．生殖与避孕， 2005，25（5）：259～262

［3］刘学高，朱伟杰．国产第一代人类绒毛膜促性腺激素（HCG）避孕疫苗第一期临床前预初试验的实施探讨．暨南大学学报，1998，19（增刊）：5～16

［4］刘学高，朱伟杰．国产免疫避孕疫苗的现状和前景．暨南大学学报，1998，19（增刊）：1～4

［5］孙奋勇，陈小佳，朱伟杰，等．猪卵透明带－3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究．生殖与避孕，2005，25 （6）：323～327

［6］张玲，谢秋玲，朱伟杰，等．重组猪卵透明带－3β截短型蛋白的同源建模．生殖与避孕，2007，27（4）：247～250

［7］朱伟杰，刘学高．精子免疫与免疫不育．见：遗传优生与生殖工程．梁志成主编．广州：暨南大学出版社， 1992．211～226［8］朱伟杰，刘学高．免疫避孕．见：中华妇产科学．曹泽毅主编．北京：人民卫生出版社，2004．2798～2811

［9］朱伟杰，刘学高．我国人绒毛膜促性腺激素免疫避孕疫苗的研究概况．见：首届广东省青年科学家论坛论文集．广东省科学技术协会编．北京：中国科学技术出版社，2000．112～116

［10］朱伟杰．抗精子免疫不育．见：临床男性学．陈栋主编．北京：科学技术文献出版社，2002．74～87

［11］Delves PJ，Lund T，Roitt IV．Antifertility vaccines． Trends Immunol，2002，23（4）：213～219

［12］Delves PJ，Lund T，Roitt IV．Future prospects for vaccines to control fertility．Trends Immunol，2002， 23（4）：220～221

［13］Gupta A，Chandrasekhar S，Pal R，et al．High expression of human chorionic gonadotrophin beta－subunit using a synthetic vaccinia virus promoter．J Mol Endocrinol，2001，26（3）：281～287

［14］Gupta SK，Gupta N，Suman P，et al．Zona pellucida－based contraceptive vaccines for human and animal utility．J Reprod Immunol，2011，88（2）：240～246

［15］Mc Laughlin EA，Aitken RJ．Is there a role for immunocontraception？Mol Cell Endocrinol，2011， 335（1）：78～88

［16］Naz RK，Gupta SK，Gupta JC，et al．Recent advances in contraceptive vaccine development：a mini－review．Hum Reprod，2005，20（12）：3271～3283

［17］Naz RK，Sacco A，Singh O，et al．Development of contraceptive vaccines for humans using antigens derived from gametes （spermatozoa and zona pellucida） and hormones （human chorionic gonadotrophin）．Human Reprod Update，1995，1（1）：1～18

［18］Naz RK．Antisperm immunity for contraception．J Androl，2006，27（2）：153～159

［19］Naz RK．Development of genetically engineered human sperm immunocontraceptives．J Reprod Immunol，2009，83（1－2）：145～150

［20］Naz RK．Status of contraceptive vaccines．Am J Reprod Immunol，2009，61（1）：11～18

［21］O'Rand MG，Widgren EE，Wang Z，et al．Eppin：an effective target for male contraception．Mol Cell Endocrinol，2006，250（1－2）：157～162

［22］Purswani S，Talwar GP．Development of a highly immunogenic recombinant candidate vaccine against human chorionic gonadotropin．Vaccine，2011，29 （12）：2341～2348

［23］Talwar GP，Gupta JC，Shankar NV．Immunological approaches against human chorionic gonadotropin for control of fertility and therapy of advanced－stage cancers expressing HCG/subunits．Am J Reprod Immunol，2011，66（1）：26～39

［24］Talwar GP，Vyas HK，Purswani S，et al． Gonadotropin－releasing hormone/human chorionic gonadotropin beta based recombinant antibodies and vaccines．J Reprod Immunol，2009，83（1－2）：158～163

［25］Williams J，Samuel A，Naz RK．Presence of antisperm antibodies reactive with peptide epitopes of FA－1and YLP12in sera of immunoinfertile women． Am J Reprod Immunol，2008，59（6）：518～524