膜孔径测定：间接法的应用和低分辨率扫描电镜的挑战

膜孔径是表征膜性能的重要指标，它是决定膜的分离透过特性的最主要因素。有关膜孔径的测量方法有直接法和间接法。直接法是通过透射或扫描电子显微镜（TEM、SEM）实际观测膜的孔径及其分布，由于是直接观察膜的孔结构，被认为是最可信赖、最可靠的方法。缺点是设备昂贵、操作复杂、测试样品面积极小，因而应用上受到一定限制。直接法更多地用来表征膜的结构特征。间接法是目前使用较普遍的方法，它是利用与膜孔存在有关的物理性质来测定膜孔的特性。在这类方法中，由于利用的是有关膜孔的物理效应和对应物理量的测定，因此，需要一些附加条件才能通过适当公式进行孔径及其分布的计算。

（一）直接法

1.电子显微镜　电子显微镜可以用来表征膜的孔径、孔径分布及膜的形态结构。它可分为：扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）。常规电子显微镜观察膜的结构时，样品的制备是至关重要的，它关系到实验的成败。对于含水的膜样品，必须使膜保持干燥，而不正确的干燥方法将导致膜结构的不可逆变形。电子显微镜观测的湿膜样品，要经过脱水、蒸镀、复型等处理。常用的脱水方法如下：

（1）逐级脱水法。先将膜样品用5%锇酸固定，然后在提取器中用CCl4或乙醇逐级脱水，再用环氧树脂包埋固化，最后用超薄切片机将固化的样品切成薄片。该样品适用透射电子显微镜的观察。

（2）低温冷冻脱水法。先将膜样品放在液氮或其他低温介质中冷冻，使膜样品中的水急速冷冻为细小的结晶，然后在低温（至少低于-60℃）和低真空下，使冷冻的结晶逐级升华。这样制备的膜样品不收缩，经镀金或复型，可用电子显微镜观测。

（3）临界点干燥法。将样品浸入低于临界点温度的液体中，然后将容器密闭并少许加温，使系统通过临界点并达到略高于临界点的温度，这时膜样品中的水分全部气化，然后在高于临界点的温度下放气，把压力降到常压，从而获得干燥的膜样品。通常不用水作临界点干燥的液体，而用其他过渡液如CO2或氟里昂来代替水。

由于微滤膜的孔径为0.05～10μm，恰好在电子显微镜的分辨率内，所以电子显微镜特别适用于微滤膜的结构研究。而超滤膜的孔径为1～30nm，常规扫描电镜的分辨率低于5～10nm，所以采用低分辨率扫描电镜观测超滤膜的结构是困难的。但是，电子显微镜观测超滤膜的不对称性及各向异性是非常有用的。采用扫描电镜观测膜的结构时，由于样品很小，所以要注意所观测点的代表性及真实性。

透射电镜的分辨率比扫描电镜要高得多，为3～4Å，可以用来观测微滤膜的表面结构，但是样品的制备是关键。通过正确的样品制备，高分辨率的透射电镜可以观测超滤膜的表面细微结构。Sheldon工作的一个重大成就是采用透射电镜观测亲水性纤维素膜YM10表面的孔结构，并发现了膜的表层及次表层是纤维状结构，而用扫描电镜及原子力显微镜观测结果为球状结构。

另外，采用电子显微镜可以确定膜的孔径分布。利用Hagen-Poiseuille方程由电子显微镜观测的数据计算膜的通量。但由于膜孔的弯曲性，死端孔及膜材料的化学性质不同，导致通量的计算值与实测值有差别。

2.原子力显微镜　原子力显微镜（AFM）是Binning等1986年建立起来的，用来表征微滤膜及超滤膜表面的一种新的扫描探针显微镜方法。当直径小于100Å的非常尖的探针以恒定的力扫过被测表面时，探针顶部的原子与样品表面发生London-vander Waals相互作用。通过检测这些力就可得到样品表面的扫描结果。运用微尺度悬臂，可以实现在小于lnN（=10-9N）的很小相互作用力下检测，因此可以使用该方法检测膜的表面。如图2-10、图2-11所示。

图2-10　原子力显微镜原理图

图2-11　聚砜超滤膜（背面）的球状表面AFM照片（放大45000倍）

与扫描电镜相比，原子力显微镜测量膜的孔径值偏大，平均大2～3倍。这也说明扫描电镜样品表面的金属涂层对于非常小的膜孔来讲是一个不可忽视的因素，当AFM探针的尺寸与所测孔径相当时也易产生此误差。另外，电子显微镜的样品制备过程中膜孔结构的变化也是造成误差的原因之一。

原子力显微镜不仅可以检测膜的孔径及分布，而且可以表征表面粗糙度。膜的表面粗糙度信息对于复合膜的表征是有帮助的。但由于膜表面的粗糙，检测结果很难分析，造成了膜的孔径分布难以准确测量。原子力显微镜与电子显微镜结合对于膜的结构研究是很有用的。该法的特点是样品无需预处理，且可以在大气及水或其他液体中测量，特别适用于含水膜的结构表征；原子力显微镜可以得到膜的三维图像，这是AFM独特的优点。

（二）间接法

1.泡点法　泡点法是表征膜的最大孔径及膜的完整性的一种广泛使用的方法。其原理如图2-12所示，膜首先被液体完全润湿，所有膜孔都充满液体，过滤器底部与压缩空气或氮气相连，当空气或氮气压力逐渐增大到一定值时，气泡会通过膜，而通过第一个气泡时所对应的压力即为该膜的泡点压力。

图2-12　膜的泡点压力测试示意图

泡点压力与膜的孔径之间的关系可用Cantor方程来表示：

式中：D——膜孔直径，μm；

σ——液体表面张力，N/m；

p——气体压力，Pa；

θ——液体与孔壁间的接触角（°）。

如果考虑膜孔的实际形状，引入修正系数k，可用Laplace-Young方程来表示：

式中，k为修正系数，理想状态下即膜孔为圆柱型毛细管时，k=1，由式（2-1）中可知，泡点压力所对应膜孔为膜的最大孔径。如果水为润湿液体，理想状态下Cantor方程可简化为式（2-3）：

实际测量时，膜应被液体完全润湿并用该液体清洗干净，否则将给所测的泡点压力带来误差。亲水性膜采用水为润湿液体，对于疏水性膜一般采用醇如异丙醇为润湿液体。膜的实际泡点压力通常比它的理论值要低，如表2-3所示，这可能是膜的实际孔径大于标称孔径的原因，另外接触角不确定性及膜的孔型不规则性对此也有影响。

表2-3　微孔滤膜泡点压力的理论值与实测值之间的关系

Elsford认为，对于孔径为10～100nm的超滤膜，膜的孔径比它实际所截留的粒子大3倍；对于孔径为0.1～0.5μm的微滤膜，膜的孔径比它实际所截留的粒子大1.7～2倍；对于孔径为0.5～1μm微滤膜，膜的孔径比它实际所截留的粒子大1～1.4倍，如表2-4所示。Elsford的观点已被电子显微镜证实。即使膜孔规则的核孔迹膜其实侧值与理论值也有区别，例如，聚碳酸酯微孔滤膜其标称孔径为10，50，100nm，而原子力显微镜测量膜孔径为18，65，113nm，这可能是由于膜孔重叠的结果。

表2-4　微孔膜标称孔径与实测值的区别

注　1～5是Millipore混合纤维素酯微滤膜（膜孔径0.025～0.45μm）；6～10是Sartorius CA微滤膜（膜孔径0.20～1.2μm）。

根据泡点法的原理，可用低于泡点的压力检测膜的缺陷，检测膜组件的完整性。但由于超滤膜的孔径太小，为0.001～0.05μm，理论上泡点压力值为27.5～275.0MPa，因此，通常不采用泡点法检测超滤膜的平均孔径及最大孔径。由于缺少像泡点法这样简单有效的实验方法，大部分超滤膜不能作为卫生型除菌过滤器。

2.液体流速法　液体流速法是通过测定膜的渗透速率，采用Poiseuille定律求得膜的平均孔径。一般采用纯水为测试流体。该法假定：膜上的孔均为圆柱型通孔，所有的孔与膜面垂直，水与膜的接触角为0。根据Poiseuille定律求出膜的平均孔径r。

式中：r——膜的平均孔径，m；

ρr——空隙率；

Δp——跨膜压差，Pa；

J——渗透速率，m3/（m2·s）或cm3/（cm2·s）；

μ——水的黏度，Pa·s；

L——膜的厚度，m。

空隙率可用下式计算：

式中：d水——水的密度，g/m3；

A——膜面积，cm2。

由于膜孔并非模型化的，有人提出用弯曲率因子k加以修正，则式（2-4）相应修正为：

该法特点是简单实用，其测量范围大体为0.02～0.2μm孔径；该法测量对传递起作用的活性孔；在测量过程中该法无需对膜进行处理，并采用水为测试介质，因此更接近实际状况；但是该法也是模型依赖型，与实际情况有区别。

3.汞压入法　汞压入法测定在压汞仪中进行，其基本原理同前述。

r=2σcosθ/p

对于汞，σ为480mN/m，θ取140°，则上式简化为：

式中：p——外加压力，Pa；

r——在给定压力p下，汞能进入孔中的最大孔半径，10-10m。

采用汞压入法测定膜孔径分布的函数D（r）为：

式中：Vg——该样品的比孔容积；

V——样品中孔半径小于r的孔容积。

因此，只要测定出上式右边各物理量，就可算出D（r），然后以D（r）对r绘图，可得到孔径分布曲线。

用压汞仪测定孔径的实验装置如图2-13所示。实验时，将一定重量的样品装入样品球中，在133.3×10-3Pa下，脱附系统及样品中的气体，然后将汞加入填汞器，使汞与膨胀计中的铂电阻丝接触，此后不断增加外压，膨胀计中的汞不断地渗入样品的孔中，从而引起膨胀计汞体积的变化，汞体积的变化量ΔV是通过测定膨胀计中铂丝电阻的改变值ΔR换算而得到的。即ΔV=KΔR，K为膨胀计常数（mL/Ω），是预先测定的。

图2-13　压汞仪测孔径的实验装置流程图

1—密封盖　2—恒温室　3—高压筒体　4—测孔室　5—膨胀计　6—恒温水　7—检流计
8—惠斯登电桥　9—压紧螺帽　10—倍加器　11—中压阀　12—低压阀　13—微压阀
14—高压阀　15—进油阀　16—泄放阀　17—油杯　18—手揪泵

压汞法的缺点如下：根据假定细孔的形态为垂直的圆柱形，因而对其他一些形态的细孔就难以适用；由于高压使可塑性滤膜发生形变；在计算中θ取140°也不是十分合理，实际上θ因不同的材料而有所差异，在如此高压情况下，接触角是否与常压时相同尚有疑问；由于很多物质会在汞中溶解而导致汞的污染，从而使θ值发生变化，这些均是造成测试误差的重要原因，且操作者要与汞接触，影响健康，是其又一缺点。

4.标准颗粒过滤法　标准颗粒过滤法主要是根据对一些已知颗粒直径的物质进行过滤，检查它们是否通过膜孔而估算出孔径大小的方法，主要用于微孔滤膜孔径测量。已知物质一般采用美国陶氏化学公司出售的单分散聚苯乙烯胶乳，它的平均直径有0.48μm和0.81μm两种，是极为均匀的粒子。库尔特孔径测定仪就是采用这种原理测定微滤膜的孔径，已在膜生产厂得到应用。自动粒子计数器可用于测量孔径大于0.5μm微滤膜的孔径。

用聚苯乙烯胶乳检测有两种方法：

①将浓度为（106～109）个粒子/mL的胶乳分散液用膜过滤，然后用电镜对膜表面上的粒子和膜孔径进行观察对比，从而估算出孔径的大小。

②与方法①的做法相同，只不过以光散射法检验滤液中是否有胶乳透过，根据不同胶乳粒子的大小来判定滤膜的孔径。

5.细菌过滤法　细菌过滤法是过滤含有已知体径的微生物（如灵杆菌为0.5μm，绿脓杆菌为0.3μm）的液体，细菌的含量一般要求为（108～109）个/（cm2膜），然后在一定条件下对滤液进行培养，并观察滤液是否混浊（标志细菌繁殖），以此间接地推测滤膜孔径的范围。孔径与指示菌的对应关系见表2-5。此方法对于制药业中的无菌检验是一种高效而灵敏的手段。

表2-5　微孔滤膜的孔径与指示菌(www.xing528.com)

6.气体吸附—脱附法　气体吸附—脱附法是测定多孔材料中孔径和孔径分布的常用方法。该方法的基本原理为在不同的相对压力下测定一种惰性气体（如氮气）的等温吸附和脱附线。一般情况下，由于吸附和脱附过程中产生的毛细管冷凝和蒸发效应不同，造成脱附曲线并不与吸附曲线重合，可观察到滞后效应。这种滞后效应反映多孔材料孔的形状和孔径分布。

当相对压力较低时，气体分子在膜孔壁上形成了一层薄的吸附层，吸附层的厚度t可用Halsey方程描述：

式中：t——吸附层的厚度，Å；

x=p/p0。

假设膜上的孔均为圆柱型，半径为r的毛细孔，其蒸气压下降由Kelvin方程得到：

式中：p——测量压力，Pa；

p0——饱和蒸气压，Pa；

γ——液氮的表面张力，N/m；

V——液氮的摩尔体积，m3/mol；

rk——孔半径，m；

R——气体常数；

T——绝对温度，K；

θ——液氮与膜孔壁之间的接触角，（°）。

该式可简化为：

吸附—脱附法可以测定超滤膜包括对传递不起作用的死端孔在内的所有微孔及孔径分布。该法要求采用适当的模型来表征孔的几何形状，在此基础上由等温吸附—脱附曲线确定孔径及孔径分布。但该方法要求测试前将膜干燥，因此该法适用于孔径分布窄的无机膜的表征。

7.热测孔法　利用多孔材料中固—液相变热来确定多孔材料的孔径及孔径分布。随着孔径变小，孔内水的凝固点下降，并且对应特定的值。对于含水的圆柱状孔，其孔径可由下式计算：

式中：rp——孔半径，nm；

ΔT——过冷度，℃。

该式适用于固态到液态的熔化过程。Brun给出了表观熔化热W（J/g）与熔点下降之间的关系式：

利用差热扫描量热仪（DSC）可以测量固—液转变过程的热效应。根据熔化曲线确定孔径及孔径分布。

该法与气体吸附—脱附法具有较好的一致性。但Zeman等指出采用热测孔法测量的聚醚砜超滤膜（PES UF）的孔径比高灵敏度的SEM所测值高一个数量级。

热测孔法表征膜孔径的特点：

（1）热测孔法可测量大于50nm的膜孔径。

（2）湿膜可直接用于测试，避免了膜的干燥。

（3）水作为探针液体，与膜的实际状况更为相似。

（4）该法需对膜孔的形状模型化，有时与实际状况不符。

（5）小于1.5nm的微孔难以测量。

（6）该法测量膜的所有的孔，包括非功能性孔及空腔。

8.渗透测孔法　该法由Eyraud和Katz引入并由Cuperus进一步完善，用于测量超滤膜的孔径及孔径分布。该法只测定对传递有效的活性孔。在非对称膜中决定传递过程的是很薄的皮层，采用这种方法可以得到皮层中活性孔的孔径及孔径分布的数据。

渗透测孔法的基本原理：利用可冷凝气体使部分孔被堵住，同时测定气体通过膜的通量。在相对压力为1时，膜中的所有孔均充满液体，气体不能透过；随着相对压力减少，最大孔中的冷凝蒸汽按Kelvin公式蒸发，从而可以测量通过这些开孔的通量；当压力进一步下降，更小的孔也可以让气体扩散过去。由于孔的半径与特定的蒸汽压相对应，测量气体的通量就可以得到这些特定孔的数目的信息，从而得到孔径分布的数据。

所选用的冷凝气体必须不使膜溶胀，应选用与膜的亲和性很低且蒸汽压易于在整个范围内调节的物质，另外，有机蒸汽的种类还影响t层（单吸附层）的厚度。

图2-14　渗透测孔法实验流程图

渗透测孔法实验流程如图2-14所示，被实验的超滤膜要求干净干燥，在实验中应保持膜两侧不存在静压差，以防任何对流性的气体穿过膜，气体仅仅通过扩散进行传递，通过测量两种非冷凝气体之一的通量得到膜的孔径分布。

冷凝气体在膜孔中的脱附也可以用Kelvin方程（2-10）描述。由于孔壁上有冷凝气体的吸附层，可以用方程（2-12）来计算孔的半径。吸附层的厚度除了与相对压力有关外，与冷凝气体的种类及冷凝气体与膜的相互作用也有关系。

图2-15是渗透测孔法的典型实验结果。甲醇为冷凝气体，氧气在甲醇中的扩散与Knudsen流相比可以忽略不计，当相对压力低于0.5时，几乎所有的孔被清空，对应的Kelvin半径为1.5nm。继续降低相对压力，氧的通量进一步增加，这是甲醇在膜壁上进一步脱附造成吸附层的厚度减少的缘故。

图2-15　渗透测孔法实验中氧气的通量与甲醇相对压力的关系

渗透测孔法测量膜孔的范围为2nm＜Dk＜50nm，当膜孔直径大于50nm时，膜孔的冷凝点压力非常接近p0，以致于难以精确测量；当膜孔直径小于1.5nm时，Kelvin方程不再适用。

渗透测孔法表征超滤膜的特点：

（1）该法只表征膜中参与传递的活性孔；

（2）在测试过程中不会产生溶质对膜的污染问题；

（3）由于测试条件要求严格，该法不能大规模应用；

（4）该法也是模型依赖型，假设膜孔为圆柱型非连接孔，而忽略了膜孔的形状、表面性质及连通性等；

（5）该法只能测量2～50nm的超滤膜；

（6）实际操作中膜一般湿法保存，该法要求膜干净、干燥，因此在样品制作中将可能改变膜的性能。

9.液体置换法　早在21世纪初Bechold和Erbe就引入了液体置换法测定孔径分布的概念，后来Munari对该法又做了进一步改进。该方法是用一种液体来置换已经存在于膜孔内并与之不相溶的另一种液体。该法所用的两种液体一种用来充满膜孔，另一种用来置换膜孔内的液体。一般来讲，选择水为置换液体，选择比水的表面张力低两个数量级的液体作为被置换液体。

该法的基本原理为开始压力较低，大孔中的液体首先被置换出来，随着压力的增加，较小孔内的液体被置换出来，膜的通量继续增大，通过Hagen-Poiseuille方程可以测量通量与孔径之间的关系，进而确定膜的孔径分布。

图2-16是液体置换法测试的典型曲线，图中pmax与pmin分别代表膜的最小孔与最大孔。

图2-16　液体置换法通量与压力关系曲线

图2-17是液体置换法测试仪器原理图。该仪器由计算机控制，可以进行数据采集及处理，液体泵为膜测试池提供膜的润湿液体及排斥液体。通量由电子天平测量，压力由压力传感器检测。在实验中要注意，所选润湿液体要不对膜产生溶胀，膜应该用纯水漂洗干净，以防表面活性剂溶出。

假设膜孔为理想圆柱型，膜孔长度相同，充填液体与膜的接触角为零。根据Laplace-Young（Cantor）方程得到压力与膜孔径的关系式：

图2-17　液体置换法测试仪器原理图

式中：γ——两种液体间的表面张力。

根据Hagen-Poiseuille方程，Grabar and Nikitine提出了孔径分布函数：

式中：J——渗透速率，m3/（m2·h）；

p——压力，MPa；

c、c1——系数。

对图2-17中仪器测得的数据进行处理可以得到膜的孔径分布，如图2-18所示。

图2-18　膜的孔径分布图

液体置换法的特点：

（1）该法只测量对传递起作用的活性孔，测量孔径范围较宽，可以对超滤膜及微滤膜进行测定。

（2）该法易于操作，并可用计算机自动控制。

（3）该法仍是模型依赖型，与实际状况不尽相同。