皱胃酶及其制备方法

皱胃酶是从犊牛胃的第四室（皱胃）中提取的，是干酪制作最常用的凝乳酶，有液状、粉状及片状三种制剂。

（一）皱胃酶的性质

皱胃酶的等电点pI为4.45～4.65，作用的最适pH为4.8左右，凝固的适温为40～41 °C。皱胃酶在弱碱（pH为9）、强酸、热、超声波的作用下可失活。制造干酪时的凝固温度通常为30～35 °C，时间为20～40 min。如果加过量的皱胃酶、温度上升或延长时间，则凝块变硬；20 °C以下或50 °C以上则皱胃酶活性减弱。动物血清中有阻碍皱胃酶作用的因子存在，其中马、猪的血清阻碍作用强，其阻碍物质存在于黏蛋白中。

与其他任何动物蛋白酶一样，皱胃酶也以其酶原、凝乳酶前体形式分泌，皱胃酶原可自动被激活，这是通过酸化到pH 2～4，切除酶原N端的含44个氨基酸的肽实现的。

皱胃酶已在分子水平上得到了研究。该酶的结晶在19世纪60年代就已获得，是含约323个氨基酸残基的单链多肽，分子量为35 600。其一级结构已经建立，并已获得相当数量二级与三级结构的数据与信息。该分子中存在两个作用域，它们被一活性位点裂缝所分割开，这一活性位点中含有具催化活性的精氨酸基团Asp32和Asp215。小牛皱胃酶含三种同工酶，主要是A和B，还有少量的C。皱胃酶A和B分别来自皱胃酶原，即皱胃酶的前体A和B，而皱胃酶C则是皱胃酶A的降解产物。皱胃酶A、B、C的活性分别为120 RU/mg、100 RU/mg、50 RU/mg。皱胃酶A与B的差异仅在于244位的氨基酸不同，分别为Asp和G1y，其最佳pH值分别为4.2和3.7。

（二）皱胃酶的制备

动物皱胃酶的制作通常采用l0%NaCl抽提胃组织，抽提液经活化、标准化后便制得皱胃酶。

1.原料的制备

皱胃酶是从犊牛或羔羊的皱胃中分泌的。当幼畜接受了母乳以外的饲料时，就开始分泌胃蛋白酶。这两种酶的分离非常困难。另外，当接受饲料时，也会形成多脂肪的皱胃，使净化过程发生困难。因此，应尽可能选择出生后数周以内的犊牛皱胃。尤其是出生后两周以内皱胃酶的效力最强，喂料以后就不能应用。用于提取皱胃酶的幼畜，须在屠宰前10 h施行绝食，屠宰后立即取出皱胃，因皱胃的上半部分泌酶的数量较多，所以切取时上部应在胃的第三室的末端切取（图8-1），下部扎住胃的一端，将胃吹成球状，悬挂于背阴通风的地方使其干燥；或者将胃切开进行阴干。

图8-1　皱胃的切断部位图

a－a：正确的切取线；b－b：不正确的切取线

2.皱胃酶的浸出

将干燥的皱胃细切，用含4%～5% NaCl与10%～12%乙醇（防腐剂）的溶液浸提。将多次浸出液合在一起离心分离，除去残渣，加入5% 1mol/L的HCl，使黏稠物质沉淀分离后，再加入5%NaCl，使浸出液含盐量达10%。调整pH至5～6（防止皱胃酶变性）即为皱胃酶的液体制剂。

3.皱胃酶的结晶

将皱胃酶的浸出液经透析和醋酸处理（pH约4.6）并离心后，将沉淀的粗酶反复经透析、酸化、离心2～3次后得到的精制品，在0～4 °C条件下经2～3 d即可形成微小针状结晶。将结晶溶于水，再经透析，除去酸、盐等物质，最后冷冻干燥成粉末状，即为可长期保存的皱胃酶的粉状制剂。

（三）皱胃酶的凝乳作用及其活力测定

1.影响皱胃酶凝乳的因素

可分为对皱胃酶的影响和对乳凝固的影响。

（1）pH。在pH低的条件下，皱胃酶活性增高，并使酪蛋白胶束的稳定性降低，导致皱胃酶的作用时间缩短，凝块较硬。

（2）钙离子。钙离子不仅对凝乳有影响，而且也影响副酪蛋白的形成。酪蛋白所含的胶质磷酸钙是凝块形成所必需的成分。如果增加乳中的钙离子可缩短皱胃酶的凝乳时间，并使凝块变硬。

（3）温度。皱胃酶的凝乳作用在40～42 °C条件下最快，在15 °C以下或65 °C以上则不发生作用。温度不仅对副酪蛋白的形成有影响，更主要的是对副酪蛋白形成凝块过程的影响。(www.xing528.com)

（4）牛乳的加热。牛乳若先加热至42 °C以上，再冷却到凝乳所需的正常温度后，添加皱胃酶，则凝乳时间延长，凝块变软，该现象被称为滞后现象，其主要原因是乳在42 °C以上加热处理时，其中的酪蛋白胶粒中磷酸盐和钙被游离出来所致。

2.皱胃酶的活力及活力测定

皱胃酶的活力单位（Rennin Unit，RU）是指皱胃酶在35 °C条件下，使牛乳40 min凝固时，单位质量（通常为1 g）皱胃酶能使若干倍牛乳凝固而言。即1 g（或1 mL）皱胃酶在一定温度（35 °C），一定时间（40 min）内所能凝固牛乳的体积（mL）。正常的小牛犊中每1 mL抽提液约含60～70酶活力单位。凝乳酶中90%以上的牛乳凝结活力源于高品质的牛犊皱胃酶，其余活力则来自胃蛋白酶，随着小牛的不断成长，特别是喂食固体饲料后，凝乳酶的分泌降低而胃蛋白酶分泌增多。

一般的皱胃酶活力测定方法是：取100 mL原料乳于烧杯中，加热到35 °C，然后加入10 mL 1%的皱胃酶食盐水溶液，迅速搅拌均匀，并加入少许碳粒或纸屑为标记，准确记录开始加入酶溶液直到乳凝固时所需的时间（s），此时间也称皱胃酶的绝对强度。然后按下式计算活力。

式中2 400 s为测定凝乳酶活力时所规定的时间（40 min），活力确定以后，即可根据活力计算凝乳酶的用量。

例：今有原料乳80 kg，用活力为100 000单位的皱胃酶进行凝固。问需加皱胃酶多少？

解：　1：100 000＝x：80 000

x＝0.8 g

即80 kg原料乳需加皱胃酶0.8 g。

此外，也可以根据测定活力时酶的绝对强度来计算酶的用量。

例：今有原料乳80 kg，皱胃酶强度为50 s，要求在30 min内凝固。试计算皱胃酶的需要量。

根据下式进行计算：

式中　V1——皱胃酶溶液的需要量，L；

V2——原料乳量，L；

P——皱胃酶的绝对强度，s；

t——希望乳凝固的时间，min；

10——测定强度时乳量对酶溶液量的比例。

解：代入上式中