传统酸乳发酵剂中微生物种群分离

（一）分离方法

1.传统发酵剂菌粒的活化

鲜牛乳灭菌（121 °C，20 min）→接种（用冷的无菌水清洗过的传统发酵剂与灭菌鲜牛乳的比例为1∶50）→培养（25 °C，16～20 h）到牛乳凝固→无菌纱布滤出共生菌粒。并按此方法连续活化3次，使发酵液的pH达3.7左右，取最后一次发酵液备用。

2.菌种的分离

取传统酸乳发酵剂25 g→在无菌研钵内研磨成匀浆/剪细捣碎→用225 mL无菌生理盐水分次洗涤至内置玻璃珠的500 mL无菌三角瓶内→从三角瓶内取发酵液25 mL→放入含有225 mL灭菌生理盐水并内置装玻璃珠的500 mL三角瓶内→剧烈振荡大约20 min→进行10倍递增稀释至10-8（稀释度）（直至达到一个平板上生长30～300个菌落的程度）→取适当稀释液各0.1 mL→分别涂布于MRS培养基（乳酸细菌培养基），PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基），Elliker琼脂培养基上→分别置25 °C下培养72 h→挑取单菌落→移接斜面→染色后镜检。

3.乳酸菌的分离培养

MRS培养基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏10.0 g，硫酸镁0.58 g，柠檬酸氢二胺2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，吐温80 1.0 mL，硫酸锰0.25 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.4。温度25 °C下厌氧培养72 h。

4.酵母菌的分离培养

PDA培养基：马铃薯200 g ，琼脂20 g，葡萄糖20.0 g ，自来水1 000 mL，自然pH。温度25 °C下培养48 h。

5.醋酸菌的分离培养

Elliker琼脂培养基：葡萄糖5.0 g，琼脂15.0 g，乳糖5.0 g，胰脂20.0 g，蔗糖5.0 g，酵母提取物5.0 g，明胶2.5 g，乙酸钠1.5 g，抗坏血酸钠0.5 g，氯化钠4.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.3。温度25 °C下培养72 h。

（二）糖发酵试验及生理生化试验

1.菌种初筛

将6种糖发酵培养基配置好，用接菌环接取之前保藏在试管里的菌体于培养基（6种糖发酵培养基分别做3次重复试验），培养条件为35 °C±1 °C，18～24 h，依照试验结果，取优势菌株。

2.菌种复筛

把取得的优势菌株，在下面的生理生化试验中分别培养（每个试验分别重复3次）。

1）吲哚试验

在蛋白胨液体培养基中接入优势菌株，培养温度36 °C左右，培养时间48 h。把培养好的各试管里滴加0.5 mL乙醚，5 min后贴着试管内壁缓慢滴3滴吲哚显色剂（勿摇晃试管）。若试管中乙醚层变为玫瑰红色，说明为阳性反应，产生吲哚，标记“+”。

2）二乙酰试验（V.P试验）

在葡萄糖蛋白胨培养基接入优势菌株，培养温度35～37 °C，培养时间24～48 h。取2 mL培养液放入干净试管里，滴加40%的氢氧化钠2 mL，用牙签挑取肌酸0.5～1 mg于各试管中，激烈振荡试管，保持良好通气15～30 min，若试管内出现红色，即为阳性反应，标记“+”。

3）甲基红试验（M.R试验）

在二乙酰试验培养液中滴入甲基红指示剂，根据颜色变化判断：红色不变→阳性，标记“+”；变黄→阴性，标记“-”。

4）硫化氢（H2S）试验

把试验菌穿刺接种到硫化氢培养基，于35～37 °C，48 h培养后观察，若出现黑色，则说明产生硫化氢，标记“+”。

5）明胶液化试验

明胶液化试验是利用某些细菌可产生一种胞外酶——明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。将培养18～24 h试验菌穿刺接种于明胶培养基深度2/3处，然后在21 °C±1 °C条件下培养24 h。静置于4 °C冰箱中直至凝固后，观察明胶是否有被细菌液化现象，若被液化，即为阳性试验，标记“+”。

（三）传统酸乳发酵剂中的微生物成分组成

1.乳酸菌(www.xing528.com)

1）镜检鉴定

采用MRS培养基（乳酸细菌培养基）对乳酸菌进行分离培养后，采用革兰氏染色法染色，并在电子显微镜下观察，图中的蓝紫色菌群为革兰氏阳性菌G+。将电子显微镜下观察到的图与资料图作对比，根据乳酸菌的形态结构，判断该菌群为乳酸菌属，其中球状堆积成片的可能为乳酸片球菌；呈卵圆形链状连接的可能为乳链球菌；短杆状的可能为明串珠菌属；断续杆状的可能为嗜酸乳杆菌，此处仅为形态结构鉴定，实际微生物组成还应通过糖发酵试验及生理生化试验等来确定。

图4-9　乳酸菌微观图

注：（a）、（b）为镜检图；c中可能为嗜酸乳杆菌，d中为嗜酸乳杆菌；e中可能为乳酸片球菌，f中为乳酸片球菌；g中可能为乳链球菌，h中为乳链球菌；i中可能为明串珠菌属，j为明串珠菌属

2）糖发酵试验初筛结果

从新疆传统发酵剂的发酵液中分离出的菌株，通过革兰氏染色、镜检后发现，其形态主要为杆菌和球菌，对它们分别做6种糖发酵试验，发酵结果以试验中的多数为准。试验中排除以下3类菌株：不发酵乳糖的菌株、在培养液表面产生薄膜的菌株、产生芽孢的菌株。在糖发酵试验中，有些菌株结果相同，则视为同一种菌株，取其中一株再筛。表4-7是通过糖发酵试验选出的7种菌株。

表4-7　糖发酵试验结果

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应，“d”为反应不明显

3）生理生化试验复筛结果

表4-8是根据糖发酵试验初筛的结果对初筛的7种菌株再进行生理生化试验。排除反应相同的菌株，得到4株不同的菌种，分别是a号球菌、b号球菌、d号杆菌、e号球菌。结合菌株的个体形态特征、生理生化实验结果并依据参考文献，对菌种进行鉴定，结果为：a号为明串珠球菌，b号为乳酸片球菌，d号为嗜酸乳杆菌，e号为乳链球菌。

表4-8　生理生化试验结果

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应

2.酵母菌

采用PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）对酵母菌进行分离培养后，亚甲蓝染色法进行染色，并在电子显微镜下观察（见图4-10）。由于染料侵染后的死菌为蓝色，活菌为透明。通过查阅相关资料图，将实验图片与资料图作对比，根据酵母菌的形态结构，初步判断该菌群为酵母菌属，其中排列紧凑且卵圆形连结在一起的为热带假丝酵母，此处仅为形态结构鉴定，未做进一步研究。

图4-10　酵母菌微观图

注：（a）、（b）为镜检图；（c）、（d）为资料图；（e）为热带假丝酵母镜检图，（f）为热带假丝酵母资料图

3.醋酸菌

采用Elliker琼脂培养基对醋酸菌进行分离培养，革兰氏染色法进行染色，并在电子显微镜下观察（见图4-11）。根据革兰氏染色机理可知，图中的红色菌群为革兰氏阴性菌G-。通过查阅相关资料图，将实验图片与资料图作对比，根据醋酸菌的形态结构，初步判断该菌群为醋酸菌属，其中红色杆状的为醋酸杆菌，此处仅为形态结构鉴定，未做进一步研究。

图4-11　醋酸菌微观图

注：（a）、（b）为镜检图；（c）为醋酸杆菌镜检图，（d）为醋酸杆菌资料图