直投式发酵剂制备的工艺要点

（一）菌种的选择

优良乳酸菌菌株的选择是制备浓缩型发酵剂的基础。乳酸菌发酵剂的传统构成菌是由嗜热链球菌和保加利亚杆菌组成的。为了改善风味，提高保健作用，也可以在传统菌株的基础上添加嗜酸乳杆菌、双歧杆菌或同时追加这两种菌，制成现代新型的酸乳制品。此外还可以在混合菌株中添加明串珠菌、丁二酮乳链球菌等，可提高酸乳中B族维生素的含量并对香味的形成起到良好的作用。

通常可以采用以下几种指标进行菌株的评价和选择：如发酵酸乳组织状态等感官评价、发酵产酸性、产香特性、菌种活力、后熟特性、产黏特性以及蛋白分解力、抗噬菌体作用、菌株间的共生拮抗作用等，选出最佳菌种组合，以利于进一步的菌种大量富集培养。

（二）生长培养基及促生长因子

提高单位体积或单位质量内活菌数的另一关键条件是要获得乳酸菌大量生长的培养基，它是制备直投式乳酸菌发酵剂的前提。适合于工业化生产的培养基原料除了必须满足微生物的营养及工艺要求外，还应具备来源丰富、价格低廉、菌体产量高、易保持菌株平衡、容易浓缩分离细胞、适当提高抗冻性、运输方便和无毒性等特点。

生长培养基一般选择脱脂乳为基础培养基，辅以其他促生长因子或添加一些缓冲盐类制备而成。由于乳酸菌的酶系相对较单纯，不能合成多种氨基酸、维生素和生长因子，因此它们对营养物质的要求极为复杂。为使乳酸菌能正常地生长和繁殖，除供给能发酵的碳水化合物以外，还必须补充其自身不能合成的营养物质，如能源、碳源、氮源、维生素、矿物质及其他促生长因子等。通常能提供碳源的物质包括乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳清粉等，能提供氮源的物质包括脱脂乳粉、酪蛋白水解物、大豆蛋白水解物、乳清蛋白水解物、肝脏浸提物等，能提供维生素和矿物质的经典成分为B族维生素和酵母粉等。此外还可添加一些还原剂如抗坏血酸；还可添加抑制噬菌体的成分，如磷酸盐或柠檬酸盐类。

（三）菌体富集培养

乳酸菌在富集生长培养的过程中，代谢乳糖产生大量有机酸类，其中主要是乳酸。随着发酵进程的继续，乳酸含量逐渐增加，导致培养基的酸度升高，乳酸菌的繁殖受到抑制甚至死亡，所以普通发酵剂最高菌数一般仅达107～108CFU/g。制备直投式乳酸菌发酵剂首先需获得高浓度的细胞培养物，因此必须对乳酸菌进行富集培养。即在乳酸菌培养过程中，采取措施降低乳酸菌代谢产物对乳酸菌细胞生长的抑制作用，通过追加营养物质、排除代谢产物、调节pH等适当措施，解除代谢产物乳酸对细胞生长的抑制作用，延长乳酸菌的对数生长期，提高乳酸菌细胞的产率和培养液中乳酸菌细胞的浓度，从而获得较高浓度的细胞培养物。

主要的菌体富集培养方法有以下几种。

1.离心法

此法是将初步制得的乳酸菌液体浓缩物，进行离心分离，使菌体沉淀以便收集菌体细胞。但这种方法在一定程度上可造成菌体细胞的机械损伤，降低发酵剂在保存期的存活率和活性，所以目前较少单独使用，一般与其他方法配合使用。

2.恒定pH培养法(www.xing528.com)

这种方法使用间歇式或连续式发酵罐培养乳酸菌，维持培养液的pH在5.5～6.0，延长培养时间，制备含活菌数高的培养液。在培养过程中，可以使用化学中和法或缓冲盐法以维持pH稳定。但此法缺点是对菌的形态有一定的影响，且不易进行离心分离，故生产上很少单独应用。

3.膜渗析法

用膜渗析系统来生产直投式乳酸菌发酵剂是目前最先进的方法。这种方法是利用膜的选择性，将培养液与营养液进行成分交换，从而使培养液中的乳酸被部分渗出，营养液中的成分渗入培养液中以维持乳酸菌的生长繁殖。这种方法能使菌体浓度超过其他一切方法，无需离心过程，菌体浓度一般大于1011cfu/g。

4.超滤法

此法是指采用超滤与化学中和法相结合的方法。在培养前期时以化学中和法为主，发酵培养后期（约8 h以后）开始进行超滤。在一个能连续搅拌的发酵罐上连接一套超滤装置，进行乳酸菌的培养，用超滤法移去代谢产物，以不加营养液的交替式实现长时间培养。使用此方法可使乳酸菌的活菌数比传统培养法提高9倍以上。

（四）菌体细胞的分离浓缩

菌体细胞的分离收集主要有超滤和离心两种方法，超滤优于离心，但离心与超滤相比，其具有操作简便和不易污染等优点，因而离心比超滤应用普遍。但在离心过程中，由于离心的机械作用、温度和基质pH值等因素的影响，可造成部分菌体细胞死亡；同时部分菌体残留在上清液中而损失。因此，如果离心工艺掌握不当，可造成菌体死亡率和损失率增加，使活菌收率大大降低，直接导致发酵剂活菌量下降。

（五）真空冷冻干燥

乳酸菌种经液体增殖培养、离心浓缩后，可通过冷冻、低温冷冻、超低温冷冻等方法保存或经一定的方式进行干燥制成浓缩性干燥发酵剂。真空冷冻干燥方法具有其他保存方法无法比拟的优点，从而得到越来越广泛的应用。但由于菌体细胞周围环境的突然改变，微生物经受一系列物理、生化方面的变化，必然影响着细胞生物的存活率，特别是保加利亚乳杆菌对低温处理比较敏感。

提高细菌冻干存活率的方法很多，其中最重要的一是冻干保护剂的应用；二是在增殖培养基中添加某些强化物质，如吐温80、油酸、钙离子等，从而增加细胞的抗冷冻干燥能力。

冷冻保护剂可分为两类：一种是分子量较小的渗透性保护剂，如氨基酸、有机酸、低分子的糖类和糖醇类等。小分子量保护剂不仅能存在于细胞表面，而且能渗透到细胞内部，可有效防止在冷冻过程中细胞形成冰晶而损伤菌体。另一种是分子量较大的非渗透性保护剂，如蛋白质、多糖、聚乙烯吡咯烷酮和其他的合成聚合物等。大分子量保护剂是在发酵剂冻干时降低其细胞外溶质浓度，使溶液处于一个过冷状态，保护发酵剂免受离子浓缩而产生的细胞损伤。所以将合适的大分子和小分子保护剂配合使用，能在发酵剂干燥和保存期间维持较高的细胞存活率。