药物给药系统：核酸类药物的应用

核酸类生物技术药物可以分为反义核酸药物、RNAi药物、适体以及基因药物等。

1.反义核酸药物　反义核酸为与mRNA的一段顺序互补的核酸序列，能阻断mRNA的翻译；它通过与mRNA配对形成杂交双链，经RNase H水解DNA/RNA杂交双链中的RNA链，从而阻断基因的表达。反义核酸的范围又被进一步扩展，包括反义DNA、反义RNA、核酶、脱氧核酶、三链形成寡核苷酸等。

2.RNAi药物　RNA干扰是指双链RNA（dsRNA）导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解，导致基因沉默的现象，又称为转录后基因沉默（PTGS），是生物在长期进化过程中形成的对病毒、转录因子和其他转移核酸等外源物质的防御机制。与反义核酸不同，它是由dsRNA引发的选择性基因沉默。RNA干扰药物即利用这种技术获得能使致病基因失活的新型核酸药物。

3.适体药物　适体是能够与靶标分子相结合的单链核酸片断，包括DNA和RNA，长度一般为15～60个核苷酸。其功能类似于抗体，具有靶分子范围广、与配体作用亲和力高、特异性强、高度稳定性、安全经济、制备方法简单等优点。

4.基因药物　基因药物是将特定的基因经一定的载体导入人体细胞，使其在人体细胞中表达活性的多肽或蛋白，从而产生疾病治疗或预防作用的物质。基因药物实际上是利用人体细胞作为生产活性多肽或蛋白的工厂，一次应用，长期有效。

一、反义核酸药物

自1978年发现寡核苷酸在培养的细胞中具有抑制Rous肉瘤病毒的复制活性以来，反义寡核苷酸的研究日益引起人们的重视。反义核酸药物的作用靶点为基因，因而它有希望成为在分子水平上治疗目前难以治愈的各种疾病，如艾滋病、癌症、高血压和遗传性疾病的新突破口，正受到世界范围内的广泛关注。反义技术作为分子生物学的新技术，目前不仅广泛应用于生理学、病理学、药理学的基础研究，而且已成为药物发展的新兴策略。利用这一技术开发的药物称为反义药物，通常是指反义寡核苷酸，即人工合成的DNA或RNA单链片段。专门设计的反义寡核苷酸能与特异mRNA的特定序列相杂交，在基因水平上阻止致病蛋白质的产生，从而发挥治疗作用。与传统药物相比，反义药物具有更高的特异性、更优的疗效和更低的毒性。因此，反义药物越来越成为人们研究和开发的热点。

反义药物的优点：①反义药物的靶点是引起疾病的基因，通过调控基因产物的表达而发挥治疗作用；②反义药物可用于治疗传统药物不能治愈的基因疾病；③反义治疗比基因治疗更为安全有效，不良反应更少；④用于反义药物的费用可能比传统药物更为低廉。

反义药物的缺点：①不易获得定向于靶组织的反义药物；②易受到体内广泛存在的核酸酶的破坏，故血浆半衰期较短；③作用模式存在不确定性，动物模型显示有潜在的毒性；④导入细胞的主要途径是通过细胞膜的穿入或吞饮，效率很低。

反义核酸药物要成功进入临床要解决以下几个关键问题：根据选择的靶序列而设计与靶分子相适宜的反义寡核苷酸的序列，即特异性问题；要保持其本身的理化性质而最终发挥预期的生物学作用，即稳定性问题；要能迅速高效地进入靶细胞，即生物利用度问题。其中生物利用度问题的解决很大程度上要依赖于制剂学技术。目前反义核酸药物的制备主要是通过化学合成，其释药系统也大多采用普通注射剂型。

二、RNAi药物

与反义核酸相比较，siRNA具有以下特征：①高特异性。RISC指导的靶mRNA的识别是高度特异的，甚至1～2 nt的差异都会丧失RNAi的功能。②高效性。RdRP的合成功能解释了RNAi高效性和持久性，因此，在低于反义核酸几个数量级的浓度下就可以发挥功能。③稳定性。在3'具有两个突出的TT碱基的siRNA相对稳定，不容易被降解，因此相对于需要进行化学修饰来提高稳定性的反义核酸而言，稳定性有很大的提高。④可传递性。RNAi效应可以在不同细胞之间甚至某些生物体之间进行传递，并且可以遗传给下一代。⑤时间性。其抑制基因表达的作用与特定发育阶段相关，可以随意控制在任何发育阶段。

通常采用化学合成的方法制备siRNA：即分别合成正义和反义两条链，然后退火成双链。为了进一步提高其稳定性，可以对其结构进行不同的化学修饰，特别在正义链3'端的修饰不影响其RNAi效应。在siRNA的3'端共价连接一个对应于靶细胞表面受体的抗体或配体，还将提高其特异性地靶向细胞或组织的能力。

目前RNAi的研究大部分停留在细胞水平和转基因动物小鼠阶段，开发成药物所面临的困难之一就是siRNA在生物体内靶向转运。以注射剂的形式直接应用siRNA的最大问题是作用时间太短，因此，采用基因治疗的基因传递技术成为siRNA药物的研究方向。

人们已经运用一些质粒和病毒载体来提高siRNA靶向转运的效率和组织特异性。逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒和慢病毒等被证明是siRNA转运至细胞的有效途径。但病毒载体能引起有害的免疫反应，这种方法比直接注射siRNA具有更大的风险。于是人们开始研究非病毒介导的靶向转运方法。蛋白质转导技术有望成为一种有效方法，它操作简单，不影响基因的表达，并可以避免病毒载体介导的基因治疗可能发生的副作用；另外蛋白质转导技术也可能比病毒载体更有效地穿透实体肿瘤，并能透过血脑屏障，因此可以用来治疗神经系统性疾病。

三、适体药物

适体在作用方式、亲和特性、药代动力学方面均类似于治疗性单抗，但与治疗性单抗比较又具有独特优势：通过体外筛选技术可人为调控适体的特异性和亲和力；适体本身分子量小（8～15kDa），而抗体是150 kDa，容易被靶细胞吸收；至今未有证据显示适体有任何免疫原性或毒性，抗体蛋白的异源性很难克服；适体冻干后可于室温下储存数年，适当溶解后又立刻恢复其功能构像，而抗体的蛋白本质决定了它容易变性；适体系化学合成，造价低，易于大量生产，而制备单克隆抗体时间长，且成本昂贵。但适体在生物体内很快被核酸酶降解，或因分子量小而被机体迅速清除，故须对其进行各种修饰，以适应作为治疗性用药的要求。

四、基因药物(www.xing528.com)

自从20世纪70年代科学家提出可以通过向人体导入外源DNA来治疗疾病的设想，基因药物的概念首次产生，并开创了基因治疗这一新领域。如今基因药物已经从实验室研究进入了临床试验和应用阶段。与此同时，基因治疗研究的范围也得到了扩大和发展，从最初导入一个正常基因到人体靶器官，通过基因表达来治疗遗传性疾病，扩展到用DNA或RNA来治疗各种疾病。虽然现阶段多数基因治疗的研究仍然处于探索阶段，但全世界已有几百种基因药物进入了人体临床实验阶段，涉及的疾病不仅有血友病等遗传性疾病，也有许多人类高危高发性疾病，如癌症、艾滋病、帕金森氏症等。世界上第一种基因药物P53注射液（今又生）也已在我国研发成功并应用于多种肿瘤的治疗。

基因药物在治疗模式上，对传统药物、多肽/蛋白类药物以及反义核酸类药物等提出了巨大的挑战，甚至颠覆了传统意义上的药物基本观念。基因药物是以人体为加工厂，在人体细胞内产生疾病预防或治疗所需要的多肽/蛋白，甚至是反义核酸或siRNA。基因药物通过合适的载体将外源基因或核酸片段导入人体细胞内，使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的。

如何将有治疗价值的外源基因或核酸片段安全、有效、可控、简便地导入人体靶细胞，是基因药物研究的关键。所以基因药物的给药技术，即载体技术，既是基因治疗的核心，也是迄今为止该领域研究人员面临的最大困难。

理想的基因药物给药载体应当具备以下特征：

（1）安全性高载体本身不能对人体有致病性。

（2）免疫原性低载体进入体内后不引起免疫反应。

（3）生产工艺简单载体的生产工艺易于放大，适合工业化生产。

（4）包装容量大载体可容纳目的基因及相关调控元件的空间足够大。

（5）转导效率高载体转入后，可以迅速高效地表达目的产物，并发挥作用。

（6）表达水平可控可以根据病情的需要调整转基因的表达水平。

（7）组织靶向性可定向转导特定组织或细胞。

实际上，到目前为止，没有一种载体可以同时满足以上要求。所以探索和开发基因药物载体的研究任重而道远。

目前基因药物研发中应用的载体可分可为两大类：病毒载体和非病毒载体。

病毒载体是将自然界存在的病毒采用分子生物学的手段加以改造，去除掉部分或全部病毒基因，将治疗基因及基因表达所需要的功能片段克隆到病毒基因组中，再经过细胞系内包装而产生的重组病毒。病毒类载体一般具有对宿主细胞高效转染特点，因此是目前较为流行的高效的基因传递载体。许多不同类型的病毒，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等，已先后被开发成了基因治疗载体，但每种病毒对不同宿主细胞的感染效率、途径及其在细胞内的存在及存在状态都非常不同，这些特质决定了在设计基因药物时，病毒类载体具有很高的选择性。目前多数基因研究采用了病毒类载体。但同时值得指出的是，虽然经过了重组改建，多数病毒载体还是具有较高的免疫原性及相关的毒性副作用。

而非病毒载体则是载有治疗基因及其相关功能片段的DNA，如质粒、包埋有此种DNA的脂质体或纳米粒等。对于非病毒类载体，无论是质粒DNA，还是DNA-脂质体复合体，虽然其免疫原性及相关的毒副作用较小，但其体内转染效率则普遍很低。

这两类载体各自有其优点和局限性，而这些载体系统的固有特性在一定程度上限制了其在特定基因治疗中的应用。不同的疾病，对于导入基因的表达量和持续时间的要求不同，因而必须根据治疗的需要选择最佳的载体和构建合适的基因表达系统。以利用腺苷脱氨酶（ADA）治疗重度联合免疫缺陷症（SCID）为例，由于SCID是基因缺陷型疾病，而靶细胞又是不断分裂代谢的细胞，要达到长期治疗的效果，转基因就必须整合到细胞基因组中才不会在细胞分裂的过程中丢失。因此，研究者选用了能将DNA整合到细胞基因组的逆转录病毒为载体以实现长期的基因表达。而血友病，虽然也是基因缺陷型疾病，但由于肝细胞代谢周期较长，研究者选用了转染效率高而大部分转基因以非整合状态存在的重组腺相关病毒载体，以降低插入突变的风险。而我国研发的重组人p53腺病毒注射液，选择了具有复制功能而免疫原性很高的腺病毒载体，通过表达抑癌基因P53抑制肿瘤生长。