多肽/蛋白注射给药系统优化方案

多肽/蛋白类药物多数稳定性较差，在胃肠道易被降解，吸收差，一般不能口服给药，临床应用常采用注射给药。因该类药物在体内半衰期短，常常需要重复给药，长效注射给药系统的开发非常有必要。目前缓释型微球、微粒、纳米粒和脂质体等新技术被更多地应用于注射给药系统的开发，这些新技术不但可以增强药物的稳定性，同时也可以减少给药次数，改善了患者的依从性。

一、普通注射给药系统

目前多肽/蛋白类药物的普通注射给药制剂可分为两类，即溶液型注射剂和注射用冻干粉针。选用哪种剂型主要取决于药物在溶液中的稳定性。溶液型注射剂使用方便，如经过试验，在选用合适的稳定剂，采用合理的处方与工艺的条件下，即可以得到长期稳定的注射剂，当然该剂型应当是首选。否则应考虑注射用冻干粉针。

多肽/蛋白类注射剂可用于静脉注射、肌内注射或输注等，处方设计的基本要求与其他药物一致。

（一）工艺流程图（如图20-1，图20-2）

图20-1　溶液型注射剂工艺流程图

图20-2　注射用冻干粉针工艺流程图

（二）制备的要点

1.处方组成　多肽/蛋白类注射剂制备的关键是解决这类药物的稳定性问题，要根据药物的性质选用合适的稳定剂，以保证药物的稳定性。和其他药物类似，多肽/蛋白类药物的普通注射剂一般要含有稳定剂、缓冲剂、渗透压调节剂等成分。注射用冻干粉针还要加入支撑剂。

2.工艺参数　生物技术药物的活性极易受到温度的影响，在生产和储存过程中均要尽可能在低温（2～8℃）操作，避免因温度升高导致活性的下降。高压灭菌会造成生物技术药物的失活，其注射液不能采用普通注射剂高压灭菌的方法进行最终灭菌，所以在生产全过程的无菌操作是保证最终产品无菌的关键。

（三）主要仪器与设备

百级无菌操作间（台）、配液罐、循环泵、无菌滤器、无菌灌装设备、冷冻干燥设备、高压灭菌器、烘箱。

（四）典型处方与分析

例　重组人红细胞生成素注射剂（2000 IU/mL）

【处方】重组人红细胞生成素2 000 000 IU；人血白蛋白2.5 g；氯化钠5.8 g；枸橼酸0.06 g；枸橼酸钠5.8 g；注射用水加至1000 mL

【制法】按处方量称取氯化钠、枸橼酸和枸橼酸钠，加入约800 mL注射用水中溶解，必要时用HCl或NaOH溶液调整pH至6.9。加入人血白蛋白，混匀。加入重组人红细胞生成素，混匀。以0.2 μm除菌滤器过滤2次，无菌分装。

【注释】重组人红细胞生成素（rHu EPO），是迄今为止技术最成熟、疗效最确切和全球销售额最高的基因工程药物，主要用于肾性贫血，也适用于外科手术红细胞动员、自体输血、癌性贫血和放化疗后贫血等适应证。

人血白蛋白来源于人体，一般不会引起免疫反应以及其他毒副作用，是最常使用的多肽/蛋白类药物的稳定剂。枸橼酸和枸橼酸钠为缓冲剂，将注射液pH维持在生理范围（6.9±0.5）。氯化钠为渗透压调节剂。

采用预充式注射器灌装，可以方便患者用药。

例　重组人红细胞生成素注射剂（2000 IU/mL）

【处方】重组人红细胞生成素2 000 000 IU；20%甘露醇200 mL；氯化钠5.85 g；枸橼酸0.062 g；枸橼酸钠5.809 g；注射用水加至1000 mL

【制法】按处方量称取氯化钠、枸橼酸和枸橼酸钠，加入约800 mL注射用水中溶解，必要时用HCl或NaOH溶液调整pH至6.9。加入20%甘露醇，混匀。加入重组人红细胞生成素，混匀。以0.2 μm除菌滤器过滤2次，无菌分装。

【注释】由于血源紧张，人血白蛋白在生产过程存在多种病毒性致病原污染的风险，部分人群因宗教原因不可以使用人血制品，其他类型稳定剂的选用成为该类制剂研究的重点。该处方系中国专利03100653.1提供的处方，其中以20%甘露醇替代人血白蛋白作为稳定剂。

二、注射用缓释微球

生物技术药物的基本剂型是常规的注射剂和注射用冻干剂，尽管其疗效早为临床所证实，但由于大多数药物半衰期短，需要长期频繁注射给药，给患者的心理与经济承受能力都增加了负担，因此开发生物技术药物的缓控释制剂是本领域研究的重点，缓控释微球是值得探索的释药体系之一。

经过20多年的发展，注射用缓释微球已经成为比较成熟的技术，其利用生物可降解聚合物作为蛋白质和多肽的输送载体，包埋蛋白质和多肽，可实现药物有效的控释缓释，从而减少给药频率，提高患者生活质量。目前，已经有黄体生成素释放激素（LHRH）、重组人生长激素（rhGH）、醋酸亮丙瑞林等多种蛋白质和多肽的缓释微球制剂上市销售。

注射微球的制备方法有多种，如相分离法、复乳液中干燥法、喷雾干燥法、低温喷雾提取法、熔融挤出法等，其中复乳液中干燥法和低温喷雾提取法最为常用。复乳法是目前制备多肽微球最常用的方法，它具有工艺稳定、设备简单等特点，但复乳法制备的微球突释效应常达15%～35%。用低温喷雾法制备的微球可明显改善药物的稳定性，制备的微球包裹率高、突释效应小，适合多肽蛋白质药物微球的制备。该法目前已被成功地运用于开发rhGH微球，rhGH微球已被美国食品与药品管理局批准上市，商品名为Nutropin Depot。

（一）工艺流程图

1.复乳液中干燥法　将生物可降解聚合物如PLGA溶解在有机溶媒（二氯甲烷或醋酸乙酯）中，水相中加入定量的多肽成溶液或混悬液。将水相加入上述有机相中，匀化或超声振荡成初乳（W/O），初乳再转入含乳化剂（如PVA）的水溶液中，搅拌成复乳（W/O/W），升高系统温度，除去有机溶媒，固液分离后，干燥待用。工艺流程见图20-3。

图20-3复乳液中干燥法制备微球工艺流程图(www.xing528.com)

2低温喷雾法　将多肽及其稳定剂的粉末或冻干品和生物可降解聚合物的二氯甲烷溶液均匀混合，混悬液经一喷头以雾状喷至冰冻的乙醇溶液中，后者界面封以液氮。在-70℃温度下，乙醇将微球中二氯甲烷不断抽提，经过滤去乙醇，得流动性佳的微球，干燥待用。工艺流程见图20-4。

图20-4　低温喷雾法制备微球工艺流程图

（二）制备的要点

1.处方组成　注射用缓释微球制备的关键是骨架材料的选择。目前常用的骨架材料为PLGA和PLA，其中以PLGA更为常用。PLGA是乳酸和羟基乙酸的共聚物，上世纪就用于外科缝线和体内埋置材料，在体内可逐渐降解为乳酸和羟基乙酸，经三羧酸循环转化为水和二氧化碳。PLGA除具有良好的生物相容性，无免疫原性和安全性高等优点外，还可以通过改变两单体的比例和聚合条件来调解其在体内的降解速度，为灵活调控释药速率提供了便利条件。

2.工艺参数　多肽/蛋白药物具有分子量大及空间结构复杂的特点，在微球制剂的制备过程中，提高蛋白质的稳定性十分重要。现阶段主要采用化学修饰、加入稳定剂及改进制备工艺来解决。

骨架材料的浓度、分子量大小和组成都会影响微球的质量。骨架材料浓度影响成球过程中聚合物的沉积速度。浓度越高，沉积速度越慢，微球结构疏松，释药速度加快。低分子量聚合物玻璃化相变温度低，释药较快。组分不同的聚乳酸复合材料其结晶度、亲水性以及降解性的差异可导致微球性质的差异。

（三）常用设备

超声波雾化喷管、低温冰柜、百级无菌操作间（台）、配液罐、循环泵、无菌滤器、无菌灌装设备、冷冻干燥设备、高压灭菌器、烘箱。

（四）典型处方与分析

例　人生长激素（rhGH）注射用缓释微球

【处方】人生长激素/锌复合物（摩尔比1∶6）24g；碳酸锌9.6 g；PLGA 126.4 g；CMC-Na 30 g；吐温2010g；NaCl9g；注射用水加至1000 mL

【制法】人生长激素/锌复合物的制备：将人生长激素溶解于4 mmol/L的碳酸钠缓冲液（pH7.2）中，得到浓度为0.1～0.5 mmol/L的溶液。加入0.9 mmol/L的醋酸锌溶液，用1%醋酸调整pH至7.0～7.4，得到人生长激素-锌复合物的混悬液。用超声波雾化喷管将混悬液微粉化，喷入液氮中，形成冷冻颗粒。冷冻颗粒置-80℃冷柜存放，至液氮完全蒸发。颗粒经冷冻干燥备用。

采用低温喷雾法制备PLGA微球。将聚合物PLGA在室温溶解于二氯甲烷，加入碳酸锌溶解，再加入人生长激素/锌复合物的冷冻干燥颗粒，超声混匀。将均匀的混悬液以雾状喷至冰冻的乙醇溶液中，乙醇界面上封以液氮。将得到的含微球的溶液置-80℃，使二氯甲烷完全萃取至乙醇中，经冷冻干燥得到流动性良好的粉末。

【注释】用锌离子与生长激素形成人生长激素/锌复合物后再制成微球，可较好地保持蛋白质在制备和释放过程中的生物学活性，起到稳定剂的作用。人生长激素和锌的最佳摩尔比为1∶6～1∶10。

碳酸锌在处方中充当锌离子储库的角色，有利于维持人生长激素-锌复合物的结构，调节其解离为水溶性蛋白的速度。在没有碳酸锌时，微球中生长激素释放速率明显加快。

聚合物PLGA为微球骨架材料，PLGA溶液的使用浓度一般为2%～20%，以5%～10%为佳。

三、其他注射给药系统

其他可用于多肽/蛋白药物的注射给药系统还有植入剂、脂质体、纳米粒、乳剂、微乳等，大部分还处于研究阶段。

已经上市的可注射型植入剂的代表为Zenica公司的Zoladex，每剂量含3.6 mg的戈舍瑞林。其制备工艺为，将药物与PLGA混合熔融，然后经多孔装置挤出为条状，切割为单剂量，灭菌后即得。

四、工业化存在的问题与分析

1.微生物污染　由于生物技术药品一般不可以采用高温和高压等常规方法灭菌，如何有效防止生产过程中微生物的污染是必须解决的问题。

用于制造生物技术药品的细菌或细胞均是活的生物体，在生产过程中影响因素多，使得生物技术药品的质量控制在一开始就注定是全过程控制。由于生物体不可以进行高压灭菌，从细胞接种、扩增、培养、收获、原液、半成品、成品等每一步都必须依靠严格的无菌操作以保证其无菌性。实施GMP管理全面优化和完善生物技术药品的生产和质量管理，使生物技术药品的质量保证有了一个质的飞跃。

2.制备工艺　为保证生物技术药物的稳定性，常采用冷冻干燥技术制备注射用冻干制剂。冻干制剂生产工艺复杂，处理不当易造成活性损失，在使用前因须用注射溶媒重建，存在污染的风险。所以对于在液态即可稳定的生物技术药物，溶液型注射剂应当是制剂研究的首选。

3.界面变性　大多数多肽/蛋白为两亲性，极易迁移或吸附到油/水或气/水界面聚集变性。复乳技术已广泛应用于微球的制备，形成油水界面就是该技术易引起变性的一大原因。虽然通过改进配方可以在一定程度上提高药物的稳定性，但要完全保持药物活性就十分困难。

非水介质包封技术为界面问题的解决提供了方案。在非水介质包封技术中，多肽/蛋白以固体的形式进行处理，分散在有机溶剂的多肽/蛋白被限制在其自身构象移动范围内，降低了药物结构紊乱和聚集的倾向。

固/油/水技术也比较适用于多肽/蛋白的包封。多肽/蛋白粉末首先被悬浮于聚合物的有机溶液中，然后与含有乳化剂的水溶液一起乳化。通过萃取或蒸发去除有机试剂使微球固化，然后洗涤和冷冻干燥。虽然微球形成和固化是在水溶液进行，但时间较短，一般不会造成药物的溶解和变性。

4.规模化生产设备　在国内研究开发中，多肽、蛋白质药物微球的制备仍主要采用复乳液中干燥法等传统方法，虽然所用装置简单、工艺易行，但也存在批量小、批间差异大、操作时间过长、微囊化过程中药物损失大、微球药物突释效应较高等问题。所以规模化生产设备的研究与开发成为微球工业化生产的又一关键。

（1）双喷嘴喷雾干燥装置：该装置类似于普通的转盘式喷雾干燥器，所不同的是其有两个平行的喷嘴。其中一个喷嘴喷出药物水溶液和聚合物有机溶媒组成的乳浊液，另一个喷嘴同时喷出形成复乳的水溶液。复乳中的有机介质在热气流中迅速蒸发而成微球。微球在离心力作用下抛出，其表面被抗黏剂包裹，这样就避免了普通转盘式单喷嘴喷雾干燥器制备微球时容易黏附在器壁表面的缺点，明显增加了微球的收得率。由于缩短了在高温器壁黏附时间，大大增加了多肽、蛋白质类药物生物活性的保留率。

（2）超声雾化-低温萃取装置：该装置经过分散、乳浊液（或混悬液）超声雾化、深冻条件下介质萃取成囊、固液分离4个步骤制备微囊，工艺简单，重现性好。人生长激素微球即使用该设备进行生产。