灭菌与无菌操作技巧与注意事项

【案例导入】

2006年8月，卫生部发出紧急通知，停用安徽华源生物药业有限公司6月以后生产的所有批次的欣弗药品。经查，该公司2006年6月、7月生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度，缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验，结果表明，无菌检查和热原检查不符合规定。

讨论：

1.注射剂为何要灭菌？

2.药物制剂在生产过程中如何防止微生物的污染？

采用灭菌与无菌操作技术的主要目的是杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽孢，最大限度地提高药物制剂的安全性，保护药物制剂的稳定性，保证制剂的临床疗效。因此，有效的灭菌方法和正确的操作方式对药品的质量至关重要。

一、概述

灭菌与无菌技术是灭菌与无菌制剂质量的重要保证。不同的剂型、制剂和生产环境对微生物限定的要求不同。

灭菌：用物理或化学方法将所有致病和非致病微生物及细菌的芽孢全部杀灭。灭菌是制剂生产中的重要操作，对注射剂、眼用制剂等无菌制剂尤为重要。

无菌：在指定物体、介质或环境中不存在任何活的微生物。

无菌操作：整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作。

防腐（抑菌）：用物理和化学方法抑制微生物生长和繁殖。

消毒：用物理和化学方法将病原微生物杀死或除去。

二、灭菌方法

通常灭菌方法可分为物理灭菌法、化学灭菌法、无菌操作法。

（一）物理灭菌法

物理灭菌法是利用高温、滤过或紫外线等杀灭或除去微生物的方法。常用的物理灭菌法包括干热灭菌法、湿热灭菌法、射线灭菌法以及过滤除菌法。

1.干热灭菌法　指在干燥环境中灭菌的方法，包括火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

（1）火焰灭菌法：是指用火焰直接灼烧而达到灭菌的方法。该法灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火材质（如金属、玻璃、瓷器等）的物品与用具的灭菌，但不适合于药品的灭菌。

（2）干热空气灭菌法：是指用高温干热空气灭菌的方法。由于在干燥状态下，热穿透力较差，微生物的耐热性强，必须长时间受高热的作用才能达到灭菌的效果。

为了确保灭菌的效果，一般规定灭菌温度与相应时间：160～170℃灭菌120 min以上；170～180℃灭菌60 min以上；250℃灭菌45 min以上（此条件下可以除去产品中的热原）。

本法的缺点是灭菌温度高、穿透力差、灭菌时间较长，不适用于橡胶、塑料及大部分药品。常用的设备有隧道灭菌系统，主要用于玻璃瓶的干燥和灭菌。

2.湿热灭菌法　指在高温高湿环境中灭菌的方法。湿热蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，因此该法的灭菌效率在相同温度下远高于干热灭菌法。

（1）热压灭菌法：是指利用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。由于高压饱和蒸汽的潜热大，穿透力强，具有很强的灭菌效果，能杀灭所有细菌繁殖体和芽孢，是灭菌制剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法。凡能耐高压蒸汽的药物制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、膜过滤器等均能采用此法灭菌。

热压灭菌法所需的温度与时间通常为115℃灭菌40 min、121℃灭菌30 min、127℃（139 kPa）灭菌15 min。

亦可采用其他温度和时间参数，但须通过实验确认合适的灭菌温度和时间。常见的设备有热压灭菌锅和热压灭菌柜，热压灭菌柜是一种常用的大型灭菌设备（图4-4）。（2）流通蒸汽灭菌法：是指在常压下，采用100℃流通蒸汽加热杀灭微生物的方法。灭菌时间通常为30～60 min。该法不能保证杀灭所有的芽孢，一般作为消毒及不耐高热无菌制剂的辅助灭菌手段。

（3）煮沸灭菌法：是指将待灭菌物置于沸水中加热灭菌的方法。煮沸时间通常为30～60 min。该法灭菌效果较差，常用于生产器具的清洁消毒。

（4）低温间歇灭菌法：是指将待灭菌物置于60～80℃的水或流通蒸汽中加热60 min，杀灭微生物繁殖体后，在室温条件下放置24 h，让待灭菌物中的芽孢发育成繁殖体，再次加热灭菌、放置使芽孢发育、再次灭菌，反复多次，直至杀灭所有芽孢。该法适合于不耐高温、热敏感物料和制剂的灭菌。其缺点是费时、工效低、灭菌效果差。

图4-4　热压灭菌柜

【拓展阅读】

影响湿热灭菌的主要因素

微生物的种类与数量：微生物的种类、发育阶段不同，其耐热、耐压性能存在很大差异，处于不同繁殖期，其耐热、耐压的次序为芽孢＞繁殖体＞衰老体；微生物的数量越少，所需灭菌时间越短。

蒸汽性质：饱和蒸汽含热量较高，穿透力较大，灭菌效率高；湿饱和蒸汽因含有水分，热含量较低，穿透力较差，灭菌效率较低；过热蒸汽温度高于饱和蒸汽，但穿透力弱，灭菌效率低，而且易影响药品稳定性。(www.xing528.com)

灭菌温度和时间：一般而言，灭菌温度越高，灭菌时间越长，药品被破坏的可能性愈大。因此，在设计灭菌温度和灭菌时间时，必须考虑药品的稳定性，即在达到有效灭菌的前提下，尽可能降低灭菌温度，缩短灭菌时间。

介质的性质：介质中含有营养物质时，能增强微生物的耐热性，营养成分愈丰富，微生物的抗热性愈强，应适当提高灭菌温度和延长灭菌时间；介质的pH大小对灭菌效果也有影响，一般情况下，微生物在中性环境中耐热性最强，在碱性环境中次之，在酸性环境中最差。

3.射线灭菌法　用辐射、微波和紫外线杀灭微生物和芽孢的方法。

（1）辐射灭菌法：是指采用放射性同位素（60Co和137Cs）放射的γ射线杀灭微生物和芽孢的方法。

该法的优点是不升高产品温度，穿透力强，灭菌效率高；适合于热敏物料和制剂的灭菌，常用于维生素、抗生素、激素、生物制品、中药材和中药制剂、医疗器械、药用包装材料以及药用高分子材料等物质的灭菌。但设备费用高，对操作人员存在潜在的危险性（操作时要注意安全防护），对某些制剂（特别是溶液型）可能产生药效降低或产生毒性物质和致热物质等副作用。

（2）微波灭菌法：是指采用微波照射产生的热能杀灭微生物和芽孢的方法。该法的特点：微波能穿透到介质和物料的深部，可以使物料外表和深部一致受热；具有低温、常压、高效、快速（一般为2～3min）、耗能低、无污染、易操作、易维护、产品保质期长等优点。该法适合液体和固体物料的灭菌，对固体物料还具有干燥作用。

（3）紫外线灭菌法：是指用紫外线（能量）照射杀灭微生物和芽孢的方法。用于紫外线灭菌的波长一般为200～300 nm，灭菌力最强的波长为254 nm。紫外线不仅能使核酸蛋白变性，还能使空气中氧气产生微量臭氧，达到共同杀菌效果。该法适合于照射物体表面灭菌、无菌室空气及纯化水的灭菌；不适合于药液的灭菌及固体物料深部的灭菌。由于紫外线是以直线传播的，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃即可吸收紫外线，且紫外线对人体有害，照射过久易造成结膜炎、红斑及皮肤烧灼等伤害，故操作者应注意劳动保护。

【拓展阅读】

紫外线灭菌应注意的问题

1.紫外线灯管的杀菌力一般随着使用时间的延长而衰退，当使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。

2.紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，而且灭菌效果与照射时间有关，应根据具体情况确定照射时间。

3.紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，如湿度增大应相应地增加灭菌的照射时间。

4.紫外线照射灯的安装形式及高度应能保证灭菌效果。

5.紫外线对人体有害，照射易造成红斑和皮肤烧伤，应注意安全保护。

4.过滤除菌法　系利用细菌不能通过致密具孔材料的原理以除去气体或液体中微生物的方法，常用于对热不稳定的药品溶液或原料的除菌。

该法属于机械除菌方法，供过滤除菌的器械称为除菌过滤器。该法适合于对热不稳定的药物溶液、气体、水等的除菌。灭菌用过滤器应有较高的过滤效率，能有效地除尽物料中的微生物，且应保证滤材与滤液中的成分不发生相互交换，滤器易清洗，操作方便等。

为了有效地除尽微生物，滤器孔径必须小于芽孢体积（≤0.5 μm）。常用的除菌过滤器是0.22 μm的微孔滤膜滤器和G6号垂熔玻璃滤器。过滤除菌应在无菌条件下进行操作，为保证产品的无菌，必须对过滤过程进行无菌检测。

（二）化学灭菌法

化学灭菌法是指利用化学药品杀灭微生物的方法。化学灭菌法仅对微生物繁殖体有效，不能杀死芽孢。

1.气体灭菌法　是指用化学消毒剂的气体或蒸汽杀灭微生物的方法。常用的化学消毒剂有环氧乙烷、甲醛、臭氧、气态过氧化氢等。该法适合于环境消毒以及在上述气体中稳定物品的灭菌，如医疗器械、塑料制品等。

2.药液灭菌法　是指利用化学杀菌剂杀灭微生物的方法。该法常作为其他灭菌法的辅助措施，适合于皮肤、无菌器具和设备的消毒。常用的化学杀菌剂有75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%～0.2%苯扎溴铵（新洁尔灭）溶液、2%甲酚皂溶液等。

（三）无菌操作法

无菌操作法是指整个操作过程在无菌条件下进行的一种生产和操作方法。该法适用于不能加热灭菌的无菌制剂，如注射用粉针剂、生物制剂、抗生素等。按无菌操作法制备的产品，一般不再进行灭菌，但某些耐热品种亦可进行再灭菌。

1.无菌操作室的灭菌　无菌操作室应定期进行灭菌，可采用紫外线、液体和气体灭菌法对无菌操作室环境进行灭菌；无菌操作室的空气灭菌常采用甲醛溶液、丙二醇、乳酸等。近年来利用臭氧进行灭菌，用来代替紫外线照射与化学试剂熏蒸灭菌，取得了令人满意的效果。

2.无菌操作　操作人员进入无菌操作室前应按规定洗手消毒，换上已灭菌的工作服和专用鞋、帽、口罩等，头发不得外露并尽可能地减少皮肤外露。操作中所用到的物料、容器具应经过灭菌，制备少量无菌制剂时，宜采用层流洁净工作台。室内操作人员不宜过多，尽量减少人员流动，操作中严格遵守无菌操作室的工作规程。

三、灭菌参数

在一般灭菌条件下，产品中还存在极微量微生物的可能性，而现行的无菌检验方法往往难以检出被检品中的极微量微生物。为了保证产品的无菌，有必要对灭菌方法的可靠性进行验证，F与F0值可作为验证灭菌可靠性的参数。

1.D值　即在一定温度下，杀灭90%微生物（或残存率为10%）所需的灭菌时间。是反映微生物耐热性的参数。

2.Z值　降低一个lg D值所需升高的温度，即灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需提高的温度。

3.F值　在一定灭菌温度（T）下给定的Z值所产生的灭菌效果与在参比温度（T0）下给定的Z值所产生的灭菌效果相同时所相当的时间。F值常用于干热灭菌，以分钟（min）为单位。

4.F0值　在一定灭菌温度（T）、Z值为10℃所产生的灭菌效果与121℃、Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。F0值目前仅限于热压灭菌。设置F0值时，应适当考虑增加安全因素，一般增加理论值的50%，即规定F0值为8 min，实际操作应控制在12 min。