共焦显微镜技术的原理与应用

共焦显微镜是20世纪80年代出现并发展起来的高精度成像仪器，是研究亚微米结构必备的科研仪器。随着计算机、图像处理软件以及激光器的发展，共焦显微镜也随之发生了很大的发展，现已广泛应用于生物学、微系统和材料测量领域中。共焦显微镜是集共焦原理、扫描技术和计算机图形处理技术于一体的新型显微镜，其主要优点为：既有高的横向分辨率，又有高的轴向分辨率，同时能有效抑制杂散光，具有高的对比度。

典型的共焦显微镜装置是在被测对象焦平面的共轭面上放置两个小孔，其中一个放在光源前面，另一个放在探测器前面，如图6.6所示。由图可知，当被测样品处于准焦平面时，探测端收集到的光强最大；当被测样品处于离焦位置时，探测端光斑弥散，光强迅速减小。因此，只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射针孔，而焦平面以外的点所发出的光线在出射针孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的针孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，两针孔共焦，共焦点为被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。

图6.6　共焦显微镜光路示意图

共焦显微镜中探测器处的针孔大小起着关键性的作用，它直接影响了系统的分辨率和信噪比。如针孔过大，则起不到共焦点探测作用，既降低了系统的分辨率，又会引入更多的杂散光；如果针孔过小，则会降低探测效率，同时降低显微图像的亮度。研究表明，当针孔直径等于艾里斑的直径时满足共焦要求，且探测效率也没有明显降低。由于针孔直径一般为微米量级，如果激光束的会聚焦点与针孔位置存在偏差，则会产生信号失真。因此，共焦显微镜一般均采用自动对焦系统，这无形中会增加测量时间。(www.xing528.com)

由于激光共焦扫描显微镜是点成像，因此要想获得物体的二维图像，需要借助于x 和y方向的二维扫描。不同的显微镜采用不同的扫描方式：

（1）物体扫描。即物体本身按照一定的规律移动，而光束保持不变。优点：光路稳定；缺点：需要大幅度的扫描工作台，因此扫描速度受到很大限制。

（2）利用反射式振镜构成光束扫描系统。即通过控制扫描振镜将聚焦光点有规律地反射到物体某一层面，完成二维扫描。其优点是精度较高，常用于高精度测量。扫描速度比物体扫描有所提高，但仍然不快。

（3）使用声光偏转元件进行扫描，通过改变声波输出频率进而改变光波的传输方向来实现扫描。其突出优点是扫描速度非常快，由美国研制的利用声光偏转器产生实时视频图像的扫描系统，扫描一幅二维图像仅需1/30 s，几乎做到了实时输出。

（4）Nipkow 盘扫描，其扫描过程是通过旋转Nipkow 盘而保持其他元件不动完成的，可以一次成像，速度非常快。但是由于成像光束是轴外光，所以必须对透镜的轴外像差进行校正，并且光能利用率很低。