食品卫生学中的微生物学标准

食品卫生学是研究食品中可能存在的、威胁人体健康的有害因素及其预防措施，提高食品卫生质量，从而保护消费者的安全的一门学科。食品微生物学标准是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度对不同食品提出的具体指标要求。在我国国家食品标准中，规定食品微生物学指标主要包括菌落总数、大肠菌群和致病菌，有些食品对霉菌和酵母菌也提出了具体要求。

1.菌落总数

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1 g或1 mL食品样品中所含细菌菌落的总数。国家标准GB 4789.2-2016（2016年12月23日颁布，2017年6月23日实施）检验程序为：25 g或25 mL样品稀释到250 mL，然后10倍梯度稀释，在普通营养琼脂培养基，（36±1）℃温箱中倒置培养（48±2）h，水产品（30±1）℃培养（72±3）h，然后进行菌落计数。

菌落计数时应注意以下几点：①若以稀释度平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；②若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；③若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；④若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300 CFU，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算；⑤菌落总数报告为CFU/g或CFU/mL。

自然界中微生物的种类很多，各种微生物的生理特性和生活条件也不完全相同。如果要检验样品中所有种类的微生物，则必须采用不同的培养基、不同的培养条件，极大地增加了工作量。研究表明，异养、中温、好氧细菌基本上代表了造成食品污染的主要细菌种类。因此严格地讲，用这种方法所得到的结果，主要是一些能在营养琼脂上生长的好氧性嗜温细菌的菌落总数。

检测食品中的菌落总数的卫生学意义在于：一是可以作为食品被微生物污染程度的标志。研究表明，食品中菌落总数能够反映食品的新鲜程度、是否变质以及生产过程的卫生状况等。通常情况下，食品中菌落总数越多，表明该食品被污染的程度越重，腐败变质的可能性越大，对人体健康威胁越大。二是可以用来预测食品可存放的期限。食品中细菌总数较多，将加速食品的腐败变质，甚至引起食用者的不良反应。因此，菌落总数是判断食品卫生质量的重要依据之一。

2.大肠菌群

大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，通常在（36±1）℃培养（48±2）h能产酸产气。通常包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。

（1）国家标准（GB 4789.3-2016）规定了大肠菌群检验程序。

大肠菌群MPN计数的检验程序见图8-1。主要步骤如下：

①样品的稀释。

a.固体和半固体样品：称取25 g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000 r/min均质1～2 min，或放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成1:10的样品匀液。

b.液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

c.样品匀液的pH应在6.5～7.5，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节。

d.用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

e.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品溶液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。

②初发酵试验。

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品溶液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Layryl Sulfate Tryptose, LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），（36±1）℃培养（24±2）h，观察倒管内是否有气泡产生，（24±2）h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

③复发酵试验。

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（Brilliant Green Lactose Bile, BGLB）管中，（36±1）℃培养（48±2）h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

④大肠菌群最可能数（MPN）的报告。

按复发酵试验确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值，如图8-1所示。

图8-1　大肠菌群MPN计数法检验程序(www.xing528.com)

（2）大肠菌群平板计数法。

大肠菌群平板计数法的检验程序见图8-2。主要步骤如下：

①样品的稀释。

按大肠菌群MPN计数法样品的稀释进行。

②平板计数。

a.选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

b.及时将15～20 mL冷至约46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar, VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于（36±1）℃培养18～24 h。

③平板菌落数的选择。

选取菌落数在15～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。

④证实试验。

从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，（36±1）℃培养24～48 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

⑤大肠菌群平板计数的报告。

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以③中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例如：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。

图8-2　大肠菌群平板计数法检验程序

一般认为，大肠菌群直接或间接来自人和温血动物的粪便，来自粪便以外的极为罕见。食品中若检出大肠菌群，表示食品受到粪便污染，其中大肠杆菌为粪便近期污染的标志，其他菌属则为粪便陈旧污染的标志。

大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量具有广泛的意义：大肠菌群在粪便中的数量最大，可以作为污染食品的指标菌；大肠菌群在外界存活期与肠道致病菌存活期大致相同，可作为肠道致病菌污染食品的指标菌。

若食品中大肠菌群超过规定的限量，则表明该食品存在被粪便污染的可能性，粪便若来自肠道致病菌携带者或者腹泻患者，则表示该食品有可能被肠道致病菌污染。因此，凡是大肠菌群超过规定限量的食品，即可确定其卫生学不合格，食用该食品是不安全的。

3.致病菌

致病菌是指能引起人和动物各种疾病的细菌，如肠道致病菌、致病性球菌和沙门氏菌等。食品中不允许有致病菌存在，这是食品卫生质量指标中绝对不能缺少的指标之一。

由于食品种类繁多，加工贮藏条件各异，而且致病菌种类也繁多，因此不能用少数几种方法将多种致病菌全部检出，而且在绝大多数情况下，污染食品的致病菌数量不多，所以在食品中致病菌的检验，不可能将所有致病菌都作为重点检验。如何检验食品中的致病菌，只能根据不同食品的特点，选定某个种类或某些种类致病菌作为检验的重点对象。例如蛋类、禽类、肉类食品必须做沙门氏菌检验；酸度不高的罐藏制品必须作肉毒梭菌及其毒素的检验，牛乳必须做结核杆菌和布氏杆菌的检验。当发生食物中毒时必须根据当地传染病的流行情况，对食品进行有关致病菌的检验，如沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等，请参考国家标准（GB 4789-2016）相关部分。

4.酵母菌和霉菌

目前，我国没有制订酵母菌和霉菌的具体指标。但很多霉菌能产生毒素，引起疾病。因此，必须对产毒霉菌进行检验，如曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等；青霉属的橘青霉、岛青霉等；镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾谷镰刀霉等。具体检验方法参考国家标准（GB 4789.15-2016）。