氨基酸生产菌株及其遗传调节突变方案

所有的微生物在培养过程中都能产生氨基酸，主要用于合成微生物细胞生长所必需的蛋白质。但是对于野生型微生物来说，微生物的细胞具有代谢自动调节系统，使氨基酸不能过量积累。如果要在培养基中大量积累氨基酸，就必须解除或突破微生物的代谢调节机制。1950年发现了大肠肝菌能分泌少量的丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸，以及加入过量的铵盐可增加氨基酸积累量的现象。1957年日本科学家Kinoshita发现在培养谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）时会产生谷氨酸的积累，从此揭开了微生物法生产氨基酸的历史新篇章。至今，几乎所有的氨基酸都能采用发酵法生产。谷氨酸是第一种应用发酵法进行工业化生产，也是目前产量最大的氨基酸，全世界年产量超过50万t，中国已经成为世界上最大的谷氨酸生产和消费国。

赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，虽然植物蛋白中含有少量的赖氨酸，但不能满足人和动物生长的需要。研究表明某些微生物中存在赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，1961年从谷氨酸棒状杆菌中分离到一株高丝氨酸营养缺陷型菌株，1969年分离到一株苏氨酸和甲硫氨酸双重营养缺陷型黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）。这两个菌株细胞内的苏氨酸合成受到了阻遏，促进了赖氨酸的积累，使赖氨酸的工业化生产成为可能。目前，微生物发酵法是唯一的赖氨酸工业化生产方法。

自20世纪70年代以来，几乎所有氨基酸发酵法生产都进行了研究和开发，已经获得工业化生产的氨基酸主要包括：谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。

目前，谷氨酸的生产菌可以从自然界中筛选得到，例如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）和黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），但是最初筛选得到的菌种积累谷氨酸的能力较弱，一般不超过30 g/L，通过不断的诱变育种，现在产生谷氨酸的能力已经超过100 g/L。然而要从自然界筛选其他氨基酸的生产菌就比较困难了，这是这些氨基酸在微生物细胞的代谢机理决定的。至今从自然界中筛选的微生物只有能积累DL-丙氨酸的嗜氨微杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）以及产生L-缬氨酸的乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum），但产量都较低。其他氨基酸的生产菌几乎都是从短杆菌属（Brevibacterium）和棒状杆菌属（Corynebacterium）通过诱变育种或基因工程技术获得。此外，噬菌体是氨基酸生产的不利因素，因此通常选育抗噬菌体的氨基酸生产菌种。

根据微生物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制，微生物发酵法生产氨基酸的菌种选育主要有选育营养缺陷型菌株、选育调节突变型菌株以及基因工程方法获得高产菌株3种方法。

（1）从营养缺陷型突变株选育氨基酸生产菌。

利用营养缺陷型突变株发酵生产氨基酸的关键是限制某种反馈抑制物或阻遏物的量，以解除代谢调节机制而有利于代谢中间体或最终产物的过量积累。因此，不同氨基酸缺陷型生长在含有限量的所要求氨基酸的培养基中，往往能产生和积累大量某种氨基酸。表7-1列出了部分氨基酸生产菌种及其遗传标记。例如L-赖氨酸的生产菌株多采用高丝氨酸缺陷型突变株，而精氨酸缺陷型突变株往往产生鸟氨酸或瓜氨酸等。

表7-1　采用营养缺陷型菌株生产的氨基酸(www.xing528.com)

（2）选育生产氨基酸的代谢调节突变菌株。

营养缺陷型突变菌株不能用于生产非分支代谢途径中末端产物氨基酸，只有选育代谢调节突变株才能生产这类氨基酸。代谢调节突变株中微生物的某些生物合成的调节机制已经缺失，强化了氨基酸的积累。选育的方法是分离对氨基酸类似物具有抗性的突变株，或从营养缺陷型菌株得到某种酶缺失的回复突变株。

一般情况下，与天然氨基酸结构类似的化合物对于某些微生物的生长具有抑制作用，这种氨基酸类似物称为“同形物”。同形物对微生物生长的抑制作用可以通过加入相应的氨基酸而解除。若在氨基酸合成的过程中加入同形物，则就会称为相应酶的共阻遏剂或共反馈抑制剂，同时又能抑制氨基酸合成蛋白质的反应。研究表明，营养缺陷型和调节突变型结合的菌株可以提高菌株积累氨基酸的能力，目前这种方法广泛地应用于氨基酸高产菌株的选育。表7-2列出了通过选育调节突变型和营养缺陷—调节突变型突变株、菌株的氨基酸积累水平。

表7-2　通过调节突变和营养缺陷-调节突变获得的氨基酸生产菌株

注：ABA-α-氨基丁酸；AEC-S-（β氨乙酰基）胱氨酸；AZ-氮鸟嘌呤；AHV-α-氨基-β-羟基戊酸；AT-氨基-酪氨酸；AU-氮尿嘧啶；AZL-氮亮氨酸；AZS-氮丝氨酸；CCL-α-氯代己内酰胺；Dec-德夸霉素；DAP-α，ε-二氨基庚二酸；ETH-乙硫氨酸；FT-氟代色氨酸；HUR-羟基尿苷；HX-氧肟酸；ISE-异丝氨酸；MFP-m-氟代苯丙氨酸；MG-巯基鸟嘌呤；MH-甲基组氨酸；ML-γ-甲基赖氨酸；MP-巯基嘌呤；MSE-γ-甲基丝氨酸；MT-甲基色氨酸；OMS-o-甲基丝氨酸；OMT-o-甲基苏氨酸；PAP-p-甲基苯丙氨酸；PFP-p-氟代苯丙氨酸；SEM-硒蛋氨酸；TA-噻唑丙氨酸；TIL-硫代异亮氨酸；TRA-1，2，4-三叠氮丙氨酸；TU-硫代尿嘧啶；Arg（Fr）-缺失精氨酸反馈抑制；Arg（Rr）-缺失精氨酸操纵子的遏制；Arg（D）-缺失精氨酸降解酶。

（3）利用基因重组技术获得氨基酸生产菌株。

20世纪80年代开始研究应用基因重组技术获得生产氨基酸的基因工程菌株。1982年将L-色氨酸操纵子缺失的突变株和携带L-色氨酸操纵子的质粒结合，成功地构建了酸性L-色氨酸的基因工程大肠埃希氏菌。该质粒的邻氨基苯甲酸合成酶和磷酸核糖氨基苯甲酸转移酶对反馈抑制不敏感，而作为宿主细胞的大肠埃希氏菌则是L-色氨酸阻遏缺陷和L-色氨酸酶缺陷型的突变株。